miniatura|Separación de tinta negra nos seus compoñentes nunha placa de cromatografía en capa fina miniatura|Imaxe que mostra unha cromatografía de capa fina de tres estándares (orto-, meta- e para-isómeros) e unha mostra miniatura|Placa de cromatografía en capa fina fluorescente baixo luz UV A cromatografía en capa fina ou CCF (ou TLC polas súas siglas en inglés de thin-layer chromatography) é unha técnica de cromatografía usada para separar mesturas non volátiles. A cromatografía en capa fina realízase nunha lámina de cristal, plástico ou folla de aluminio, que está cuberta cunha fina capa de material adsorbente, xeralmente xel de sílice, óxido de aluminio (alúmina) ou celulosa. Esta capa de adsorbente coñécese como fase estacionaria.
Despois de que se aplica a mostra na placa, un solvente ou mestura solvente (coñecida como fase móbil) avanza pola placa por acción capilar. Conséquese a separación porque os diferentes analitos ascenden pola placa de cromatografía en capa fina a diferentes velocidades. A fase móbil ten propiedades diferentes que a fase estacionaria. Por exemplo, con xel de sílice, que é unha substancia moi polar, utilízanse fases móbiles non polares como o heptano. A fase móbil pode ser unha mestura, o que permite aos químicos afinar as súas propiedades.
Despois do experimento, visualízanse as manchas, o que adoita facerse simplemente proxectando raios de luz ultravioleta sobre a lámina; as láminas son tratadas cun fósforo, e aparecen na placa manchas escuras onde os compostos separados absorben a luz que doutro modo impactaría sobre esa determinada área da placa e produciría fluorescencia. Os procesos químicos poden tamén utilizarse para visualizar as manchas; o anisaldehido, por exemplo, forma adutos coloreados con moitos compostos e o ácido sulfúrico queima a maioría dos compostos orgánicos, deixando unha mancha escura na lámina.
Para cuantificar os resultados o que se fai é que a distancia á que viaxa a substancia cosiderda se divide pola distancia total á que viaxa a fase móbil. (Á fase móbil non se lle debe permitir alcanzar o final da fase estacionaria.) Esta proporción denomínase factor de retención (Rf). En xeral, unha substancia cuxa estrutura se parece á da fase estacionaria terá un Rf baixo, mentres que outra que teña estrutura similar á da fase móbil terá un factor de retención alto. Os factores de retención son característicos, pero cambian dependendo das condicións exactas das fases móbil e estacionaria. Por esta razón, os químicos xeralmente aplican unha mostra dun composto coñecido á lámina antes de poñer a funcionar o experimento.
A cromatografía de capa fina pode utilizarse para monitorizar o progreso dunha reacción, identificar compostos presentes nunha mestura dada e determinar a pureza dunha substancia. Exemplos específicos destas aplicacións son: analizar ceramidas e ácidos graxos, detección de pesticidas ou insecticidas nos alimentos e a auga, analizar a composición de tinturas de fibras en ciencia forense, ensaiar a pureza radioquímica de radiofármacos, ou identificación de plantas mecidinais e os seus constituíntes.
Poden realizarse varias melloras no método orixinal para automatizar os diferentes pasos, ou incrementar a resolución alcanada cunha cromatografía en capa fina ou para permitir facer análises cuantitativos máis exactos. Este método denomínase cromatografía en capa fina de alto rendemento (HPTLC polas súas siglas en inglés de high-performance TLC), e tipicamente usa capas máis finas de fase esacionaria e volumes de mostra menores, o que reduce a perda de resolución debida á difusión.
Preparación da placa
Disponse comercialmente de placas de cromatografía en capa fina, con tamaños de partículas estándar para mellorar a reproducibilidade. Prepáranse mesturando un adsorbente, como o xel de sílice, cunha pequena cantidade de aglutinante inerte como o sulfao de calcio (xeso) e auga. Esta mestura esténdese como unha solución espesa sobre unha lámina portadora non reactiva, xeralmente de vidro, folla de aluminio grosa ou plástico. A placa resultante sécase e actívase por quentamento nun forno durante trinta minutos a 110 °C. O grosor da capa absorbente é tipicamente duns 0,1 – 0,25 mm para propósitos analíticos e de arredor de 0,5 – 2,0 mm para as cromatografías en capa fina preparativas.Táboas que mostran o valor do grosor de placas de cromatografía en capa fina comerciais regulares e preparativas
Técnica
O proceso é similar á cromatografía en papel coa vantaxe de que funciona máis rapidamente, produce mellores separacións e a pode elixirse entre diferentes fases estacionarias. Debido á súa simplicidade e rapidez, a cromatografía en capa fina utilízase a miúdo para monitorizar reaccións químicas e para a análise cualitativa de produtos de reacción. As placas poden ser etiquetadas antes ou despois do proceso de cromatografía usando un lapis ou outros instrumentos que non interfiran ou reaccionen co proceso.
Para realizar unha placa de cromatografía en capa fina lévase a cabo o seguinte procedemento:Thin Layer Chromatography: How To http://www.reachdevices.com/TLC.html
Usando a propiedade da capilaridade, vértese sobre a placa unha pequena pinga da solución que contén a mostra, a uns 1,5 centímetros do bordo da base. O punto onde se aplica denomínase "toque" (spot). Permítese que o solvente evapore completamente para previr que interfira con interaccións da mostra coa fase móbil no seguinte paso do proceso. Se para aplicar a mostra se usa un solvente non volátil, a placa necesita ser secada nunha cámara de baleiro. Este paso adoita repetirse para asegurarse de que sobre a placa hai analito dabondo no punto de vertido ou "toque" de inicio para obter un resultado visible. Poden situarse diferentes mostras nunha ringleira de toques á mesma distancia do bordo da base, cada un dos cales se moverá polo seu propio carreiro adxacente desde o seu propio punto de inicio. Vértese unha pequena cantidade dun solvente apropiado (eluente) nun matraz de vidro ou calquera outro contedor transparente axeitado (cámara de separación) a unha profundidade de menos dun centímetro. Na cámara ponse unha tira de papel de filtro (ás veces chamado "mecha") para que o seu fondo toque o solvente e o papel se apoie na parede da cámara e chegue case ata á parte superior do contedor. O contedor está pechado cunha tapa de vidro ou calquera outra tapa e déixase tapado durante algúns minutos para permitir que os vapores do solvente ascendan polo papel de filtro e saturen o aire da cámara. (Se non se consegue saturar a cámara o resultado será unha mala separación e os resultados non reproducibles). A placa de cromatografía en capa fina é despois situada na cámara para que a(s) mancha(s) da mostra non toquen a superficie do eluente na cámara, e péchase a tapa. O solvente móvese pola placa por acción capilar, encóntrase coa mestura da mostra e transpórtaa ao longo da placa (elúe a mostra). A placa debería retirarse da cámara antes de que a fronte do solvente alcance a parte superior da fase estacionaria (a continuación da elución daría lugar a resultados equívocos) e secarse. Sen perda de tempo márcase a fronte do solvente, que é o nivel máis lonxe ao que chegou o solvente na placa. Visualízase a placa. Como algunhas placas son pre-cubertas cun fósforo como o sulfuro de zinc, grazas ao que se poden visualizar moitos compostos usando luz ultravioleta; aparecen manchas escuras alí onde os compostos bloquean a luz ultravioleta, que non pode incidir na placa. Alternativamente, ás placas se lles pode botar un spray ou mergullar en compostos químicos despois da elución. Varios axentes de visualización poden reaccionar coas manchas das substancias para producir resultados visibles.
Proceso e principios da separación
Os distintos compostos químicos da mestura da mostra viaxan a diferentes velocidades debido a diferenzas na súa atracción á fase estacionaria e debido a diferenzas na solubilidade no solvente. Cambiando o solvente, ou quizais usando unha mestura, pode axustarse a separación de compoñentes (medido polo valor Rf). Ademais, a separación conseguida coa placa de cromatografía en capa fina pode usarse para estimar a separación dunha columna de cromatografía flash. (Un composto elúe desde unha columna cando a cantidade de solvente recollido é igual a 1/Rf.)Fair, J. D.; Kormos, C. M. J. Chromatogr. A 2008, 1211(1-2), 49-54. () Os químicos a miúdo usan a cromatografía en capa fina para desenvolver un protocolo para a separación por cromatografía e o uso da cromatografia en capa fina determina que fraccións conteñen os compostos desexados. miniatura|800px|O desenvolvemento dunha placa de cromatografía en capa fina. Unha mancha púrpura sepárase en dúas manchas, vermella e azul. miniatura|Superficie dunha táboa acabada de cortar de Eucalyptus camaldulensis mostrando cromatografía en capa fina. A banda azul horizontal débese á reacción entre o ferro da folla da serra coa que a cortaron e a madeira ácida. A separación de compostos está baseada na competición do soluto e a fase móbil para unirse a sitios na fase estacionaria. Por exemplo, se se utiliza como fase estacionaria un xel de sílice da fase normal, pode considerse polar. Dados dous compoñentes de distinta polaridade, o composto máis polar ten unha interacción máis forte coa sílice e ten, por tanto, unha mellor capacidade para desprazar a fase móbil dos sitios de unión dispoñibles. Como consecuencia, o composto menos polar móvese máis alto na placa (o que resulta nun valor máis alto de Rf). Se a fase móbil se cambia a un solvente máis polar ou mestura de solventes, mellora a súa unión á placa polar e despraza os solutos dela, polo que todos os compostos da placa da comatografía en capa fina se moverán avanzando pola placa. Dise comunmente que os solventes (eluentes) "fortes" empurran os compostos analizados pola placa, mentres que os eluentes "febles" apenas os moven. O grao da forza/debilidade depende da cobertura (fase estacionaria) da placa. Para placas cubertas de xel de sílice, a forza dos eluentes increméntase na seguinte orde: perfluoroalcano (o máis feble), hexano, pentano, tetracloruro de carbono, benceno/tolueno, diclorometano, dietil éter, etil acetato, acetonitrilo, acetona, 2-propanol/n-butanol, auga, metanol, trietilamina, ácido acético, ácido fórmico (o máis forte). Para placas cubertas de C18 a orde é a inversa. Noutras palabras, cando a fase estacionaria é polar e a fase móbil é non polar, o método é de fase normal en vez de fase inversa. Isto significa que se se usa unha mestura de etil acetato e hexano como fase móbil, engadir máis etil acetato ten como resultado valores de Rf maiors para todos os compostos na placa de cromatografía en capa fina. Cambiando a polaridade da fase móbil normalmente non resultará nunha orde inversa da separación dos compostos na placa de cromatografía en capa fina. Unha serie eluotrópica pode utilizarse como guía seleccionando unha fase móbil. Se se desexa que haxa unha orde inversa dos compostos debería utilizarse unha fase estacionaria apolar, como a sílice funcionalizada con C18.
Análise
Como os compostos químicos que se separan poden ser incoloros, hai varios métodos para visualizar as manchas: Analitos fluorescentes como a quinina poden ser detectados con luz negra (366 nm). A miúdo unha pequena cantidade dun composto fluorescente, xeralmente engádese ao adsorbente silicato de zinc activado por manganeso que permite a visualización de manchas con luz UV-C (254 nm). A capa adsorbente fluoresce con cor verde clara, mentres que as manchas do analito atemperan esta fluorescencia. Os vapores de iodo son un reactivo xeral de cor inespecífica.