A reacción en cadea da polimerase en tempo real (ou PCR en tempo real, do inglés real-time PCR), tamén chamada PCR cuantitativa (en inglés, quantitative PCR; qPCR ou Q-PCR) ou PCR en tempo real cuantitativa é unha variante da reacción en cadea da polimerase (PCR) utilizada para amplificar e simultaneamente cuantificar de forma absoluta o produto da amplificación de ácidos desoxirribonucleicos (ADN). Nela emprégase basicamente o mesmo procedemento que na PCR convencional (de punto final), un molde de ADN, polo menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón químico de reacción adecuado, e un encima ADN polimerase termoestable; a dita mestura adiciónase unha substancia marcada cun fluoróforo que, nun termociclador que conteña sensores para medir a fluorescencia producida tras excitar o fluoróforo á lonxitude de onda axeitada, permita medir a taxa de xeración dun ou máis produtos específicos. Dita medición, realízase logo de cada ciclo de amplificación e esa é a razón de que se chame PCR en tempo real (é dicir, PCR inmediata, simultánea).
A PCR cuantitativa xunto aos chips de ADN son modernas metodoloxías para o estudo da expresión xénica, aínda que outros métodos tradicionais como o northern blot, que non teñen tanta precisión, tamén se utilizan moito.Michael W. Pfaff, Ales Tichopad, Christian Prgomet and Tanja P. Neuvians (2005). Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper – Excel-based tool using pair-wise correlations Biotechonology Letters 26:509-515 A variabilidade que se introduce na cuantificación usando este tipo de PCR, e que sempre supón un erro na estimación, deriva da integridade do ADN, eficiencia encimática e outros moitos factores, polo que se desenvolveron numerosos sistemas de estandarización. Hainos para cuantificar de forma absoluta a expresión xénica, pero, de forma máis común, oriéntanse á cuantificación relativa do xene de estudo respecto doutro, denominado «normalizador», que se selecciona debido á súa expresión case constante; estes genes adoitan denominarse, en inglés, house-keeping genes (~xenes de mantemento) debido a que adoitan estar implicados en funcións básicas para a supervivencia celular, e xeralmente teñen unha expresión constitutiva (continua).Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (2002) Accurate normalisation of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes . Gen. Biol. 3: 1–12. Desta maneira, efectuando en cada experimento a medición dos xenes de interese e dividíndoos pola expresión do xene normalizador seleccionado é posible comparar os xene de interese aínda sen coñecer en termos absolutos o seu nivel de expresión. Os xenes normalizadores máis empregados son aqueles que codifican as seguintes proteínas: tubulina, gliceraldehido-3-fosfato deshidroxenase, albumina, ciclofilina, e tamén os dos ARNs ribosómicos etc.
Terminoloxía e siglas En moitos casos o molde que se emprega para a PCR cuantitativa non é desde o principio ADN, senón que pode ser ADN complementario (ADNc) monocatenario, obtido por retrotranscrición a partir dun ácido ribonucleico (ARN); neste caso, a técnica é unha "PCR cuantitativa (en tempo real) tras reversotranscriptase" (ou RT-Q-PCR ou RT-qPCR ou qRT-PCR). Nesta técnica combínase a qPCR coa RT-PCR. Debe evitarse a confusión coa técnica denominada "PCR tras reversotranscriptase" (RT-PCR, do inglés reverse transcriptase PCR), na cal existe un paso de retrotranscrición de ARN a ADN pero que non cuantifica o produto en tempo real (a non ser que se combine coa qPCR como se indicou).
As directrices MIQEThe MIQE Guidelines - Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. propoñen que a abreviatura qPCR se use para a PCR en tempo real cuantitativa e que RT-qPCR se use para a técnica combinada de PCR en tempo real e PCR tras reversotranscriptase . Aínda que o acrónimo "RT-PCR" normalmente significa só PCR tras reversotranscriptase pero non PCR en tempo real, o feito é que non todos os autores se adhiren a esta convención (e moitas veces aparece usada RT-PCR como PCR en tempo real), polo que o risco de confusión coas siglas é evidente, e hai que atender sempre ao contexto en que se usan.
Fundamento
A PCR cuantitativa realízase nun termociclador con capacidade de facer incidir sobre cada mostra un feixe de luz dunha lonxitude de onda determinada e de detectar a fluorescencia emitida polo fluorocromo excitado. Este termociclador é un aparato con capacidade para quentar e arrefriar rapidamente as mostras, de modo que se aproveiten as cualidades fisicoquímicas dos ácidos nucleicos e as encimáticas da ADN polimerase.
O proceso da PCR xeralmente consiste nunha serie de cambios de temperatura que se repiten de 25 a 40 veces, chamados ciclos, onde cada un posúe un mínimo de tres etapas: a primeira, realizada a unha temperatura de arredor dos 95 °C, permite a separación dos ácidos nucleicos bicatenarios en febras separadas; o segundo, a unha temperatura duns 50-60 °C, permite o aliñamento (annealing) dos cebadores ao ADN molde (hibridación cebador-ADN molde); o terceiro, a 68-72 °C, facilita a polimerización por parte da ADN polimerase. Debido ao pequeno tamaño dos fragmentos amplificados usualmente neste tipo de PCR pode omitirse o último paso, porque o encima pode amplificar durante a rampla (na gráfica) entre a temperatura de aliñamento e a de desnaturalización. Ademais, algúns termocicladores engaden a cada ciclo uns segundos máis a outra temperatura, por exemplo a 80 °C, a fin de reducir o ruído pola presenza de dímeros de cebadores cando se utiliza un colorante inespecífico. As temperaturas usadas e o tempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedade de parámetros, como: o encima usado para a síntese de ADN, a concentración de ións divalentes e desoxirribonucleótidos (dNTPs) na reacción e a temperatura de unión dos cebadores.
Clasificación Podemos clasificar as técnicas de PCR cuantitativa segundo o emprego de fluorocromos non específicos ou ben de sondas moleculares dependentes da secuencia. Nas técnicas baseadas en fluorocromos inespecíficos detéctase a xeración exponencial de ADN de dobre cadea empregando un fluorocromo que se une inespecificamente a aquel. Un exemplo de colorante que permite esta detección é o SYBR Green (Verde SYBR), que, unha vez excitado mediante luz azul (λmax = 488 nm) emite luz verde (λmax = 522 nm).Zipper, H. et al. (2004). Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications . Nucleic Acids Res. 32, e103. PMID 15249599 Posúe a vantaxe de requirir só un par de cebadores para efectuar a amplificación, o que abarata o seu custo; porén, só é posible amplificar un produto en cada reacción. As técnicas baseadas en sondas específicas utilizan polo menos un oligonucleótido marcado fluorescentemente. Tipicamente esta sonda está unida a dous fluorocromos e hibrida na zona intermedia entre os dous cebadores (o amplicón), é dicir, entre o cebador directo ou cara a adiante (forward) e o inverso (reverse). Deste modo, cando a sonda está intacta, presentan unha transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia (FRET). Dita FRET non se produce cando os dous fluorocromos están a certa distancia debido á degradación da sonda mediante a actividade de exonuclease 5'-3' da ADN polimerase, ou ben debido á separación física dos fluorocromos por un cambio na conformación da sonda. Isto permite monitorizar o cambio do patrón de fluorescencia e deducir o nivel de amplificación do xene.
Análise de temperatura de fusión miniatura|Distintas curvas de fusión de varias produtos de PCR (en cores distintas). Obsérvanse reaccións con amplificación dun produto específico (rosa, azul) e outras con resultado negativo (verde, laranxa); sinálase cunha frecha o pico de fusión dado para os dímeros dos cebadores, diferente ao agardado para o produto de amplificación en cuestión.
A Q-PCR permite, empregando un fluorocromo que se une inespecificamente á dobre hélice do ADN, xeralmente SYBR Green, identificar fragmentos amplificados de DNA concretos a partir da temperatura de fusión (tamén denominada valor Tm, do inglés melting temperature), que é específica para o fragmento amplificado que se está a buscar; e cuxos resultados se obteñen a partir da observación da curva de disociación das mostras de ADN analizadas.
Isto permite, a diferenza da PCR convencional, prescindir do emprego posterior de técnicas de electroforese para a visualización dos resultados de todas as mostras. Porque, malia que a PCR cuantitativa é unha técnica cinética, adoita ser avaliada a punto final. Así, con esta técnica poden obterse resultados máis rápidos, e cun menor gasto de reactivos ao aforrar os que se terían empregado na electroforese; se, segundo o criterio do investigador, posteriormente é necesario correr en xeles só aquelas mostras cuxos resultados previos na PCR en tempo real se poden considerar dubidosos ou para ratificar resultados en mostras positivas.
Cuantificación da expresión xénica A cuantificación pode realizarse en termos absolutos ou relativos. No primeiro caso, a estratexia é relacionar o sinal de amplificación obtido co contido en ADN empregando unha curva de calibrado; para este enfoque é vital que a PCR da mostra e dos elementos da recta de calibrado posúan unha mesma eficiencia de amplificación. No segundo caso, exprésase o cambio nos niveis de expresión do ARN mensaxeiro (ARNm) interpretado en forma de ADN complementario (ADNc), xerado por retrotranscrición a partir do ARNm; esta cuantificación relativa é máis doada de realizar, xa que non require curva de calibrado, e consiste na comparación entre o nivel de expresión do xene a estudar e a dun xene control (tamén chamado de referencia, interno ou normalizador ou, en inglés, housekeeping gene ou xene de mantemento).
Por tanto, na cuantificación relativa é irrelevante en que unidades se expresa, e os seus resultados son comparables entre múltiples experimentos de RT-Q-PCR. De feito, o propósito de empregar un ou máis xenes de normalización é corrixir a variación non específica, como as diferenzas na cantidade e calidade do ARN utilizado, que poden afectar ás eficiencias de retrotranscrición e de PCR. Con todo, o aspecto fundamental é que a estabilidade do xene de referencia sexa unha realidade.
A selección dos xenes internos realizouse clasicamente en bioloxía molecular analizando a estabilidade da expresión en estudos cualitativos ou de baixa sensibilidade, como o exame visual de xeles de ARN, densitometría de northern blots ou PCR semicuantitativa (PCR mimic). En plena era da xenómica, é posible realizar unha aproximación rápida a grande escala empregando chips de ADN para moitos organismos. Porén, describiuse que a maioría dos xenes usados como normalizadores na cuantificación da expresión de ARN mensaxeiro varían segundo as condicións experimentais.Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, De Borman B, Coumans B, Henne G, Grisar T, Igout A, Heinen E (1999) Housekeeping genes as internal standards: use and limits. J Biotechnol 75: 197–200 Por todo isto, cómpre realizar un estudo metodolóxico previo sobre cal empregar coa finalidade de seleccionar, con axuda de ferramentas estatísticas, os máis axeitados.
Desenvolvéronse varios algoritmos estatísticos que detectan que xene ou xenes son os máis apropiados para a normalización dun conxunto de tecidos nunhas condicións dadas: algúns, como geNORM ou BestKeeper, actúan sobre unha matriz de expresión de xenes de referencia para diversos tecidos, realizando comparacións por pares e medias xeométricas.Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (2002) Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 37: RESEARCH0034