Um modelo de reparação de quebras de cadeia dupla refere-se aos vários modelos de vias que as células utilizam para reparar quebras de cadeia dupla (DSB, do inglês double-strand breaks). A reparação de DSB é um processo celular importante, pois a acumulação de DSB não reparadas pode levar a rearranjos cromossómicos, tumorogénese ou mesmo à morte celular. Nas células humanas, existem dois mecanismos principais de reparação de DSB: recombinação homóloga (HR) e junção de extremidades não homólogas (NHEJ). A HR pode ser vista como uma forma de reparação local-específica mais precisa. Requer complexos proteicos muito maiores e mais intrincados. Estes complexos que envolvem proteínas como a RAD51 (que pesquisa a homologia e medeia a invasão da cadeia) e a BRCA2 (o bem estudado localizador da RAD51) são críticos para o suporte à replicação do ADN e para a recuperação de garfos de replicação bloqueados ou quebrados. A NHEJ modifica e liga as extremidades danificadas independentemente da homologia. Em termos de escolha da via de reparação de DSB, a maioria das células de mamíferos parece favorecer a NHEJ em vez da HR. Isto deve-se ao facto de o emprego da HR poder levar à deleção génica ou à amplificação em células que contenham sequências repetitivas. Em termos de modelos de reparação no ciclo celular, a HR só é possível durante as fases S e G2, enquanto a NHEJ pode ocorrer durante todo o processo. Estas vias de reparação são todas reguladas pelo mecanismo abrangente de resposta a danos no ADN. Além da HR e NHEJ, existem também outros modelos de reparação que existem nas células. Alguns são categorizados sob a HR, tais como o emparelhamento de cadeias dependente de síntese, a replicação induzida por quebra e o emparelhamento de cadeia simples; enquanto outros são modelos de reparação inteiramente alternativos, nomeadamente, a via de junção de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ).

Causas As DSB podem ocorrer naturalmente por fontes exógenas ou fontes endógenas. Exogenamente devido à presença de espécies reativas geradas pelo metabolismo, bem como pelo stresse de replicação e vários fatores externos, tais como a radiação ionizante ou fármacos quimioterápicos. As quebras endógenas devem-se à replicação do ADN, transcrição, bem como a processos celulares normais.

A fonte exógena de ionização que causa DSB pode ser o resultado da radiação atingir diretamente uma sequência de ADN ou de radiação localizada por moléculas vizinhas, resultando numa reação em cadeia de quebras moleculares. Cada lesão ou quebra é completamente dependente do tipo de radiação a que está exposta. Exemplos como partículas de protões e raios-X afetam as cadeias de forma diferente; enquanto os primeiros interrompem diretamente as ligações criadas pela estrutura negativamente carregada do ADN, os segundos são afetados por exposição indireta.

Nem todos os danos por DSB resultam num ciclo celular catastrófico (ex: reações endógenas). Regularmente, o ADN sofre danos oxidativos que surgem rapidamente e são depois prontamente resolvidos e reparados. Estes são designados como DSB programadas. Este dano e reparação controlados promovem a diversidade durante o ciclo celular e a divisão subsequente. As DSB programadas provaram ser imperativas para o desenvolvimento das células de mamíferos. As quebras causadas por um complexo proteico RAG são integrais para a reprodução sexual. As quebras induzem a formação de um cruzamento (crossover) para a segregação fiel de cromossomas homólogos.

Nas células de mamíferos, existem inúmeros processos celulares que induzem DSB. Em primeiro lugar, a tensão topológica do ADN proveniente da topoisomerase durante o crescimento celular normal pode causar a maioria das DSB de uma célula. Em segundo lugar, processos celulares como a meiose e a maturação de anticorpos podem causar DSB induzidas por nucleases. Em terceiro lugar, a clivagem de diferentes estruturas de ADN, como garfos de replicação de ADN invertidos ou bloqueados, alças R (R-loops) e ligações cruzadas entre cadeias de ADN (interstrand crosslinks), também pode causar DSB.

Diferentes modelos

Recombinação homóloga A recombinação homóloga (HR) envolve a troca de material genético entre cromossomas homólogos. Existem múltiplas vias de HR para reparar DSBs, que incluem a reparação de quebras de cadeia dupla (DSBR), o emparelhamento de cadeias dependente de síntese (SDSA), a replicação induzida por quebra (BIR) e o emparelhamento de cadeia simples (SSA).

A base da recombinação homóloga decorre da reacção central de pesquisa de homologia e invasão da cadeia de ADN por proteínas específicas e filamentos pré-sinápticos de ADN de cadeia simples. Segue-se a sinapse; isto é, a acção de invasão da cadeia e a formação de uma alça de deslocamento (alça D), que é formada durante a invasão entre a cadeia saliente 3' invasora e o cromossoma homólogo. Após o ADN ser recém-sintetizado, a cadeia invasora é desengatada e emparelhada durante a pós-sinapse, levando ao cruzamento (crossover) genético.

A regulação da HR em células de mamíferos envolve proteínas-chave (ou proteínas mediadoras), tais como a BRCA1 e a BRCA2. Está bem documentado que a BRCA1 desempenha um papel na ressecção de extremidades. O seu papel tem sido associado a diferentes mecanismos, tais como o antagonismo, a promoção e a inibição de certos complexos proteína/ssDNA. A BRCA2, um gene supressor de tumor que está no centro de uma vasta investigação, demonstrou experimentalmente atuar em conjunto com o complexo BRCA1-PALB2 para carregar a RAD51 no ssDNA revestido com RPA. In vivo, mutações na BRCA2 levam à predisposição para cancro do ovário ou da mama, sendo evidente que a sua função é integral para a reparação de quebras de dsDNA.

Reparação de quebras de cadeia dupla thumb|Três sub-vias possíveis para a reparação de uma quebra de cadeia dupla via recombinação homóloga: conversão génica, BIR e SDSA. A conversão génica refere-se ao modelo de reparação de quebras de cadeia dupla. A outra sub-via é o emparelhamento de cadeias dependente de síntese. A SSA é a quarta sub-via e não é mostrada neste diagrama.|411x411px A HR repara DSB copiando moléculas de ADN intactas e homólogas. As extremidades rombas da DSB são processadas em ssDNA com extensões 3', o que permite que a recombinase RAD51 (homólogo eucariótico da RecA procariótica) se ligue a elas para formar um filamento de nucleoproteína. A função do filamento é localizar o ADN molde e formar uma molécula heteroduplex conjunta. Outras proteínas, como a proteína RP-A e a RAD52, também coordenam a formação do heteroduplex; a proteína RP-A tem de ser removida para que a RAD51 forme o filamento, enquanto a RAD52 é um mediador-chave da HR. Posteriormente, o ssDNA 3' invade o ADN molde e desloca uma cadeia de ADN para formar uma alça D. A ADN polimerase e outros factores acessórios seguem-se, substituindo o ADN em falta através da síntese de ADN. A ligase une então a quebra da cadeia de ADN, resultando na formação de duas junções de Holliday. As cadeias de ADN recombinadas sofrem então resolução por clivagem. A orientação da clivagem determina se a resolução resulta em produtos com ou sem crossover. Finalmente, as cadeias separam-se e revertem para a sua forma original.

A principal via de resolução baseia-se no complexo BTR (BLM helicase-Topoisomerase IIIα-RMI1-RM2), onde induz a resolução das duas junções de Holliday, mas esta via favorece a clivagem sem crossover.

Emparelhamento de cadeias dependente de síntese Fonte:

O emparelhamento de cadeias dependente de síntese (SDSA) é o mecanismo de reparação preferencial em células somáticas. A via do SDSA é semelhante à DSBR até logo após a formação da alça D. Em vez de formar junções de Holliday após a síntese de ADN, a cadeia nascente dissocia-se através da helicase RTEL1 e emparelha-se de volta com a outra extremidade da cadeia ressectada. Isto explica por que o SDSA resulta numa via sem crossover. A lacuna restante é preenchida e o corte é unido pela ligase.

Replicação induzida por quebra Embora exista pouca investigação em relação à replicação induzida por quebra (BIR), sabe-se, através de múltiplas experiências utilizando leveduras como modelo, que se trata de um mecanismo de recombinação de uma só extremidade, onde apenas uma das extremidades de uma DSB estará envolvida na invasão da cadeia. A BIR, no entanto, provou funcionar durante o reinício da replicação e na reparação de telómeros erodidos, bem como, inesperadamente, na independência da RAD51 em relação ao processo de BIR. Isto significa que, ao contrário da DSBR, a BIR não se liga de volta à segunda extremidade da DSB após a invasão da cadeia e replicação.

Emparelhamento de cadeia simples O emparelhamento de cadeia simples (SSA) envolve sequências homólogas/repetidas que flanqueiam uma DSB. O processo começa com o factor-chave de ressecção de extremidades CtIP, que medeia a ressecção das DSB, resultando na formação de uma extensão de ssDNA 3'. Mediado pela RAD52, as sequências homólogas flanqueadoras são emparelhadas, formando um intermediário de sinapse. Em seguida, a extensão 3' não homóloga é removida pelo complexo ERCC1-XPF através de clivagem endonucleolítica, com a RAD52 a aumentar a eficiência da actividade do complexo ERCC1-XPF. Só após a remoção do ssDNA 3' é que a polimerase preencherá as lacunas em falta e a ligase unirá as cadeias. Como o SSA resulta na deleção de sequências repetitivas, isto pode potencialmente levar a uma reparação propensa a erros.

O SSA difere do SDSA e da DSBR de várias formas. Por exemplo, a extensão 3' após a ressecção no SSA emparelha-se com as sequências repetidas/homólogas da outra extremidade, enquanto noutras vias ocorre a invasão de cadeia para outro molde de ADN homólogo. Além disso, o SSA não requer RAD51, porque não envolve invasão de cadeia, mas sim o emparelhamento de sequências homólogas.

Junção de extremidades não homólogas A junção de extremidades não homólogas (NHEJ) é uma das principais vias na reparação de DSB, além da HR. O conceito básico da NHEJ envolve três etapas. Primeiro, as extremidades de uma DSB são capturadas por um grupo de enzimas. As enzimas formam então uma ponte que liga as extremidades da DSB e, por fim, segue-se a religação das cadeias de ADN. Para iniciar todo o processo, o complexo proteico Ku70/80 liga-se às extremidades danificadas das cadeias da DSB. Isto forma um andaime preliminar que permite o recrutamento de vários factores da NHEJ, tais como a subunidade catalítica da proteína quinase dependente de ADN (DNA-PKcs), a ADN ligase IV e a XRCC4 para formar uma ponte e unir ambas as extremidades das cadeias de ADN danificadas. Isto é seguido pelo processamento de quaisquer terminais de ADN não ligáveis por um grupo de proteínas que inclui a Artemis, PNKP, APLF e Ku, antes de a XRCC4 e a ADN ligase IV ligarem o ADN em ponte.

Junção de extremidades mediada por microhomologia A junção de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ), também conhecida como NHEJ alternativa, é outra via para reparar DSBs. O processo da MMEJ pode ser resumido em cinco etapas: o corte 5' para 3' das extremidades do ADN, emparelhamento de microhomologia, remoção de abas heterólogas e ligação e síntese de ADN para preenchimento de lacunas. Verificou-se que a selecção entre MMEJ e NHEJ depende principalmente dos níveis de Ku e do ciclo celular em curso.

A regulação das vias de reparação de quebras de cadeia dupla

Resposta a danos no ADN