A enxeñaría de proteínas é a disciplina técnica utilizada para desenvolver proteínas útiles e valiosas por medio do deseño e a produción de polipéptidos non naturais, a miúdo alterando secuencias de aminoácidos atopadas na natureza. É unha disciplina nova, na que se están a facer moitas investigacións para comprender o pregamento de proteínas e o recoñecemento dos principios para o deseño de proteínas. Foi utilizada para mellorar a función de moitos encimas para a catálise industrial. É tamén un mercado de servizos e produtos, cun valor estimado de 168.000 millóns de dólares en 2017.

Hai dúas estratexias xerais para realizar a enxeñaría de proteínas: deseño de proteínas racional e evolución dirixida. Estes métodos non son mutuamente excluíntes, xa que a miúdo se aplican ambos. No futuro, un coñecemento máis detallado da estrutura das proteínas e da súa función, e os avances en cribado de alto rendemento, poden expandir grandemente as capacidades da enxeñaría de proteínas. Finalmente, poderán incluírse mesmo aminoácidos non naturais por medio de métodos máis modernos, como o código xenético expandido, que permiten codificar novos aminoácidos no código xenético.

Estratexias

Deseño racional

No deseño de proteínas racional utilízase o coñecemento detallado da estrutura e función dunha proteína para facerlle os cambios desexados. En xeral, isto ten a vantaxe de ser barato e tecnicamente doado de realizar, xa que os métodos de mutaxénese dirixida ao sitio están ben desenvolvidos. Porén, o seu maior inconveniente é que o coñecemento estrutural detallado dunha proteína adoita non estar dispoñible, e, incluso cando está dispoñible, pode ser moi difícil de predicir os efectos de varias mutacións porque as máis das veces a información estrutural proporciona unha imaxe estática da estrutura dunha proteína. Con todo, programas como Folding@home e Foldit utilizaron técnicas de crowdsourcing para aprender máis sobre os motivos presentes no pregamento das proteínas.

Os algoritmos para o deseño de proteínas computacional tratan de identificar novas secuencias de aminoácidos que son de baixa enerxía cando se pregan nunha estrutura diana preespecificada. Mentres que o espazo secuencia-conformación que se debe investigar é grande, a necesidade máis complicada de satisfacer no deseño de proteínas computacional é unha función de enerxía rápida pero exacta que poida distinguir as secuencias óptimas doutras similares subóptimas.

Aliñamento de secuencias múltiples

Sen información estrutural sobre unha proteína, a análise de secuencias adoita ser útil para dilucidar información sobre a proteína. Estas técnicas implican o aliñamento de secuencias diana da proteína con outras secuencias de proteínas relacionadas. Este aliñamento pode mostrar os aminoácidos que están conservados entre especies e son importantes para a función da proteína. Estas análises poden axudar a identificar os aminoácidos clave que poden servir como sitios diana para realizar mutacións. O aliñamento de secuencias múltiples utiliza bases de datos como PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE e BALIBASE para establecer referencias cruzadas de secuencias diana de proteínas sen secuencias coñecidas. As técnicas de aliñamento de secuencias múltiples lístanse máis abaixo.

Este método empeza realizando un aliñamento de secuencias por pares usando os métodos k-tuple ou Needleman–Wunsch. Estes métodos calculan unha matriz que representa a semellanza por pares entre os pares de secuencia. Os valores de similitude son despois transformados en valores de distancias que se utilizan para producir unha árbore guía usando o método de unión de veciños. esta árbore guía emprégase despois para render aliñamentos de secuencias múltiples.

Clustal omega Este método pode aliñar ata 190.000 secuencias utilizando o método k-tuple. As secuencias seguintes son agrupadas usando os métodos mBed e k-means. Constrúese unha árbore guía usando o método UPGMA que é o empregado polo paquete de aliñamento HH. Esta árbore guía utilízase para xerar aliñamentos de secuencias múltiples.

MAFFT Estes métodos utilizan a transformada de Fourier rápida (FFT) que converte secuencias de aminoácidos en secuencias compostas de valores de volume e polaridade para cada residuo de aminoácido. Esta nova secuencia úsase para atopar rexións homólogas.

K-Align Este método utiliza o algoritmo de correspondencias de cadeas aproximadas de Wu-Manber para xerar aliñamentos de secuencias múltiples.

Comparación de secuencias múltiples por expectación de logaritmos (MUSCLE) Este método utiliza distancias Kmer e Kimura para xerar aliñamentos de secuencias múltiples.

T-Coffee Este método utiliza funcións obxectivas de consistencia baseadas en árbores para a evolución dos aliñamentos. Este método é un 5–10% máis exacto que Clustal W.

Análise coevolutiva A análise coevolutiva tamén se coñece como mutación correlacionada, covariación ou cosubstitución. Este tipo de deseño racional implica cambios evolutivos recíprocos en loci que interaccionan evolutivamente. Xeralmente este método empeza coa xeración de aliñamentos de secuencias múltiples curados para a secuencia diana. Este aliñamento sométese despois a un refinamento manual que supón a eliminación de secuencias con moitos ocos, así como secuencias con baixa identidade de secuencia. Este paso incrementa a calidade do aliñamento. Seguidamente, utilízase o aliñamento procesado manualmente para medidas coevolutivas adicionais usando algoritmos de mutacións correlacionadas distintas. Estes algoritmos teñen como resultado matrices de valores de coevolución. Estas matrices fíltranse aplicando varios tests de significatividade para extraer valores de coevolución significativos e eliminar o ruído de fondo. Despois vólvense avaliar as medidas coevolutivas para asegurar o seu comportamento e rigor. Finalmente, valídanse experimentalmente os resultados desta análise coevolutiva.

Predición estrutural A síntese de novo de proteínas benefíciase do coñecemento de estruturas proteicas existentes. Este coñecemento de estruturas proteicas existentes axuda á predición de novas estruturas proteicas. Os métodos de predición de estruturas das proteínas poden ser de catro clases posibles: ab initio, métodos baseados en fragmentos, modelaxe de homoloxía e enfiado de proteínas (protein threading).

Ab initio Estes métodos implican a modelaxe libre sen usar ningunha información estrutural sobre o molde. Os métodos ab initio tratan de predicir as estruturas nativas das proteínas correspondentes no mínimo global da súa enerxía libre. Algúns exemplos de métodos ab initio son AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS e ENCEPP12. Os pasos xerais a seguir nos métodos ab initio comezan coa representación xeométrica da proteína de interese. Despois, desenvólvese un modelo de función de enerxía potencial para a proteína. Este modelo pode crearse usando potenciais de mecánica molecular ou funcións potenciais derivadas da estrutura da proteína. Despois do desenvolvemento dun modelo potencial, aplícanse á proteína técnicas de busca de enerxía, como as simulacións de dinámica molecular, simulacións Monte Carlo e algoritmos xenéticos.

Baseados en fragmentos Estes métodos usan información de bases de datos sobre estruturas para atopar correspondencias con estruturas homólogas para crear secuencias de proteínas. Estas estruturas homólogas ensámblanse para dar estruturas compactas usando procedementos de cuantificación e optimización, co obxectivo de conseguir o valor de enerxía potencial máis baixo. Servidores web para a información de fragmentos son: I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM, e ANGLOR.

Modelaxe de homoloxía Estes métodos están baseados na homoloxía de proteínas. Estes métodos tamén se coñecen como modelaxe comparativa. O primeiro paso na modelaxe de homoloxía é xeralmente a identificación de secuencias molde de estrutura coñecida que son homólogas da secuencia buscada. Unha vez que a secuencia buscada é aliñada á secuencia molde. Seguindo o aliñamento, as rexións conservadas estruturalmente son modeladas usando a estrutura molde. Despois disto, faise a modelaxe das cadeas laterais e bucles que son distintas das do molde. Finalmente, a estrutura modelada é sometida a un refinamento e avaliación da calidade. Os servidores dos que se dispón para datos de modelaxe de homoloxía son os seguintes: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA e I-TASSER.

Enfiado de proteínas (protein threading)

O enfiado de proteínas (protein threading) pode utilizarse cando non se pode atopar un homólogo fiable para a secuencia buscada. Este método empeza por obter unha secuencia buscada e unha biblioteca de estruturas molde. Seguidamente, a secuencia buscada é "enfiada" sobre as estruturas molde coñecidas. Estes modelos candidatos son valorados usando funcións de cuantificación, baseándose en modelos de enerxía potencial tanto da secuencia buscada coma da secuencia molde. Despois selecciónase a correspondencia co modelo de enerxía potencial máis baixa. Os métodos e servidores para recuperar datos de enfiado e realizar cálculos son os seguintes: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP server, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPRED3D, LIBRA, TOPITS, RAPTOR, COTH e MUSTER.

Para máis información sobre o deseño racional ver mutaxénese dirixida ao sitio.

Unión multivalente A unión multivalente pode utilizarse para incrementar a especificidade de unión e afinidade a través de efectos de avidez. Ter múltiples dominios de unión nunha soa biomolécula ou complexo incrementa a probabilidade de que ocorran outras interaccións por medio de eventos de unión individuais. A avidez e a afinidade efectiva poden ser moito maiores que a suma das afinidades individuais, o que proporciona unha ferramenta efectiva en custo e tempo para a unión dirixida a diana.

Proteínas multivalentes As proteínas multivalentes son relativamente fáciles de producir por informacións postraducionais ou multiplicando a secuencia de ADN que codifica a proteína. A principal desvantaxe das proteínas multivalentes e multiespecíficas é que poden incrementar a afinidade efectiva para unha diana dunha proteína coñecida. No caso dunha diana inhomoxénea usar unha combinación de proteínas que resulta na unión multiespecífica pode incrementar a especificidade, o cal ten unha grande aplicabilidade en terapéuticas de proteínas.

O exemplo máis común de unión multivalente son os anticorpos, e hai unha extensa investigación sobre anticorpos biespecíficos. As aplicacións de anticorpos biespecíficos cobren un amplo espectro que inclúe a diagnose, formación de imaxes, profilaxe e terapia.

Evolución dirixida