Metaxenómica

miniatura|A metaxenómica permite o estudo de comunidades microbianas como as presentes neste regato no que se verteu a drenaxe dunha mina de carbón ao aire libre. A metaxenómica é o estudo do material xenético recollido directamente de mostras ambientais. Este amplo campo pode tamén denominarse xenómica ambiental, ecoxenómica ou xenómica da comunidade.

Mentres que a microbioloxía tradicional, a secuenciación de xenomas microbiana e a xenómica dependían de facer cultivos clonais, a secuenciación de xenes ambientais inicialmente clonaba xenes específicos (xeralmente os do ARNr 16S) para obter o perfil de diversidade dunha mostra natural. Ese traballo revelou que a gran maioría da biodiversidade microbiana non se detectaba utilizando os métodos baseados no cultivo.

Debido á súa capacidade de revelar a diversidade previamente oculta de vida microscópica, a metaxenómica ofrece unha potente lente para ollar o mundo microbiano que ten a potencialidade de revolucionar a comprensión de todo o mundo vivo. Como o prezo da secuenciación de ADN segue baixando, a metaxenómica agora permite que se investigue a ecoloxía microbiana a unha escala e detalle moito maiores que antes. Os estudos recentes usan a secuenciación directa "de escopeta" ou a PCR para obter mostras pouco nesgadas de todos os xenes de todos os membros das comunidades mostreadas.

Termo

O termo "metaxenómica" foi utilizado primeiramente por Jo Handelsman, Jon Clardy, Robert M. Goodman, Sean F. Brady e outros e apareceu primeiro nunha publicación de 1998.. O termo fai referencia á idea de que un conxunto de xenes secuenciados a partir da nube ambiental pode ser analizado dun xeito análogo ao do estudo dun só xenoma. En 2005, Kevin Chen e Lior Pachter (investigadores da Universidade de California, Berkeley) definiron a metaxenómica como "a aplicación das modernas técnicas xenómicas sen necesidade de illar e cultivar en laboratorio especies individuais".

Historia

A secuenciación convencional empeza co cultivo de células idénticas como fonte de ADN. Porén, os estudos metaxenómicos iniciais revelaron que probablemente hai un gran grupo de microorganismos en moitos ambientes que non se poden cultivar e, por tanto, non se poden secuenciar. Estes estudos iniciais estaban enfocados ás secuencias do ARN ribosómico de 16S, que son relativamente curtas, a miúdo conservadas nunha especie, e xeralmente diferentes entre as distintas especies. Moitas secuencias de ARNr 16S viuse que non pertencían a ningunha especie cultivada, o que indica que hai numerosos organismos que non foron nunca illados. Estes exames dos xenes do ARNr tomados directamente do ambiente revelaron que os métodos baseados no cultivo microbiolóxico atopan menos do 1% das especies bacterianas e arqueanas que realmente existen nunha mostra. Gran parte do interese da metaxenómica débese a que estes descubrimentos mostran que a gran maioría dos microorganismos pasaron ata agora inadvertidos.

Os primeiros traballos moleculares neste campo foron dirixidos por Norman R. Pace e colegas, que utilizaban a PCR para explorar a diversidade das secuencias de ARN ribosómico. Os coñecementos obtidos con estes avances levaron a Pace a propoñer a idea de clonar o ADN directamente de mostras ambientais xa en 1985. Isto orixinou o primeiro informe do illamento e clonación de ADN en masa procdedente dunha mostra ambiental, publicado por Pace e colegas en 1991 mentres Pace estaba no Departamento de Bioloxía da Universidade de Indiana. Fixéronse grandes esforzos para asegurarse de que estes non eran falsos positivos da PCR e apoiaban a existencia dunha comunidade complexa de especies inexploradas. Aínda que esta metodoloxía estaba limitada a explorar xenes non codificantes de proteínas altamente conservados, apoiaba as observacións microbiolóxicas iniciais baseadas na morfoloxía que indicaban que a diversidade era moito máis complexa do que se coñecía por métodos de cultivo. Pouco despois, Healy informou do illamento metaxenómico de xenes funcionais procedentes de "zoobibliotecas" construídas a partir dun cultivo complexo de organismos ambientais cultivados en laboratorio ou herbas secas en 1995. Despois de deixar o laboratorio de Pace, Edward DeLong continuou traballando neste campo e publicou traballos que puxeron os fundamentos preliminares da filoxenia ambiental baseadas nas sinaturas de secuencias do ARNr 16S, empezando coa construción de bibliotecas por este grupo a partir de mostras mariñas.

En 2002, Mya Breitbart, Forest Rohwer e colegas usaron a secuenciación de escopeta ambiental (véxase máis adiante) para mostrar que 200 litros de auga de mar conteñen uns 5000 virus distintos. Os estudos seguintes mostraron que hai máis de mil especies virais nas feces humanas e posiblemente un millón de virus diferentes por quilogramo de sedimentos mariños, incluíndo moitos bacteriófagos. Esencialmente todos os virus destes estudos eran especies novas. En 2004, Gene Tyson, Jill Banfield, e colegas na Universidade de California, Berkeley e o Joint Genome Institute secuenciaron o ADN extraído dun sistema de drenaxe ácido de minas. Esta iniciativa tivo como resultado a obtención de xenomas completos ou case completos dunha manchea de bacterias e arqueas que anteriormente se resistiran aos intentos de cultivalas.

miniatura|200px|Diagrama de fluxo dun proxecto metaxenómico típico.

Craig Venter, comenzando en 2003, foi o líder da fundación privada que traballou en paralelo co Proxecto Xenoma Humano, e liderou a Expedición de mostras oceánicas global, que circunnavegou o planeta e recolleu mostras metaxenómicas durante a viaxe. Todas estas mostras son secuenciadas utilizando a secuenciación de escopeta, coa esperanza de que se identificasen novos xenomas (e, por tanto, novos organismos). O proxecto piloto, realizado no mar dos Sargasos, atopou ADN de case 2000 especies diferentes, incluíndo 148 tipos de bacterias nunca antes vistas. Venter circunnavegou o globo e explorou exhaustivamente a costa oeste dos Estados Unidos e completou unha expedición de dous anos de duración para explorar o mar Báltico, o Mediterráneo e o mar Negro. A análise de datos metaxenómicos recollidos durante esta viaxe revelou a existencia de dous grupos de organismos, un composto de taxons adaptados a condicións ambientais de 'fartura ou fame' e outro composto por relativamente poucas taxons pero máis abundantes e amplamente distribuídos principalmente composto por plancto.

En 2005 Stephan C. Schuster na Unversidade estatal de Penn e colegas publicaron as primeiras secuencias dunha mostra ambiental xerada con secuenciación de alto rendemento, neste caso a pirosecuenciación masivamente paralela desenvolvida por 454 Life Sciences. Outra publicación inicial nesta área apareceu en 2006 feita por Robert Edwards, Forest Rohwer e colegas da Universidade estatal de San Diego.

Secuenciación

A obtención de secuencias de ADN de lonxitude maior que uns poucos milleiros de pares de bases a partir de mostras ambientais foi moi difícil ata que os recentes avances nas técnicas de bioloxía molecular permitiron a construción de bibliotecas en cromosomas artificiais bacterianos (BACs), que proporcionan mellores vectores para a clonación molecular. miniatura|250px|A secuenciación de escopeta ambiental (ou, en inglés, ESS, Environmental Shotgun Sequencing). (A) Toma de mostras do hábitat; (B) partículas filtradoras, normalmente por tamaño; (C) lise e extracción do ADN; (D) clonación e construción da biblioteca; (E) secuenciación de clons; (F) ensamblaxe das secuencias en cóntigos e armazóns.

Metaxenómica de escopeta

Os avances en bioinformática, os refinamentos na amplificación do ADN e a proliferación do poder computacional axudaron enormemente a análise de secuencias de ADN obtidos de mostras ambientais, o que permitiu a adaptación da secuenciación de escopeta ou shotgun ás mostras metaxenómicas (coñecida tamén como escopeta de metaxenoma completo ou secuenciación WMGS, de whole metagenome sequencing). Esta estratexia, usada para secuenciar moitos microorganismos cultivados e o xenoma humano, corta o ADN aleatoriamente, secuencia moitas secuencias curtas e reconstrúeas nunha secuencias consenso. A secuenciación de escopeta revela os xenes presentes en mostras ambientais. Historicamente, as bibliotecas de clons eran utilizadas para facilitar esta secuenciación. Porén, cos avances nas tecnoloxías de secuenciación de alto rendemento, o paso da clonación xa non é necesario e poden obterse grandes rendementos de datos secuenciados sen este paso que require un intenso traballo e supón un colo de botella no proceso. A metaxenómica de escopeta proporciona información tanto sobre que microorganismos están presentes coma sobre que procesos metabólicos son posibles na comunidade. Como a obtención de ADN ambiental é en boa medida incontrolada, os organismos máis abundantes nunha mostra ambiental están moito máis representados nos datos de secuenciación resultantes. Para conseguir a alta cobertura necesaria para resolver por completo os xenomas dos membros da comunidade subrepresentados, cómpre extraer grandes mostras, a miúdo prohibitivamente custosas. Por outra parte, a natureza aleatoria da secuenciación de escopeta garante que moitos destes organismos, que doutro modo pasarían desapercibidos usando as técnicas de cultivo tradicionais, estarán representados por polo menos algúns pequenos segmentos de secuencia. Unha estratexia cada vez máis usada combina a secuenciación de escopeta e a captura da conformación do cromosoma (Hi-C), que mide a proximidade de calesquera dúas secuencias de ADN nunha mesma célula, para guiar a ensamblaxe xenómica.

Secuenciación de alto rendemento

Os primeiros estudos metaxenómicos realizados usando secuenciación de alto rendemento usaban a pirosecuenciación pyrosequencing 454 masivamente paralela. Outras tres tecnoloxías comunmente aplicadas ás mostraxes ambientais son a Ion Torrent Personal Genome Machine, a Illumina MiSeq ou HiSeq e o sistema Applied Biosystems SOLiD. Estas técnicas para a secuenciación do ADN xeran fragmentos máis curtos que a secuenciación de Sanger; O Ion Torrent PGM System e a 454 pyrosequencing normalmente produce lecturas de ~400 pares de bases, Illumina MiSeq produce lecturas de 400 a 700 pares de bases (dependendo de se se utilizaron opcións de extremos apareados) e SOLiD produce lecturas de 25 a 75 pares de bases. Historicamente, as lonxitudes destas lecturas eran significativamente máis curtas que a lonxitude de ~750 pares de bases da secuenciación de Sanger típica, porén a tecnoloxía de Illumina está aproximándose rapidamente a este punto de referencia. Porén, esta limitación compénsase polo número moito máis grande de lecturas de secuencias. En 2009, os metaxenomas pirosecuenciados xeran 200–500 megabases, e as plataformas de Illumina xeran unhas 20–50 xigabases, pero estes rendementos incrementáronse en varias ordes de magnitude nos últimos anos. Unha vantaxe adicional da secuenciación de alto rendemento é que esta técnica non require a clonación de ADN antes da secuenciación, eliminando un dos principais nesgos e colos de botella nas análise de mostraxes ambientais.

Bioinformatica

Os datos xerados polos experimentos metaxenómicos son dun enorme volume e intrinsecamente ruidosos, xa que conteñen datos fragmentados que poden representar ata 10000 especies. A secuenciación do metaxenoma do rume da vaca xerou 279 xigabases ou 279 miles de millóns de pares de bases de datos de secuencias nucleotídicas, mentres que o catálogo de xenes do microbioma intestinal identificou 3,3 millóns de xenes ensamblados a partir de 567,7 xigabases de datos de secuencias. A recollida, tratamento e extracción de información útil bioloxicamente a partir de conxuntos de datos deste tamaño supón retos computacionais significativos para os investigadores.

Prefiltrado da secuencia