miniatura|Proteínas da membrana do eritrocito separadas por SDS-PAGE segundo a súa masa molecular. A SDS-PAGE (do inglés sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis ou electroforese en xel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico) é unha das variantes da electroforese en xel de poliacrilamida, un método analítico usado en bioquímica para a separación de moléculas cargadas en mesturas pola súa masa molecular nun campo eléctrico. Utiliza o dodecil sulfato sódico (SDS) para axudar a identificar e illar moléculas de proteínas.
A SDS-PAGE é un sistema electroforético descontinuo desenvolvido por Ulrich K. Laemmli, que se utiliza habitualmente como método para separar proteínas de masas moleculares entre 5 e 250 KDa. A publicación que a describe é o artigo máis frecuentemente citado dun só autor e o segundo máis citado globalmente.Neue Zürcher Zeitung: Interview with Ulrich Lämmli in German. NZZ Folio, No. 11, 2005. Accessed March 4, 2012.
Propiedades
miniatura|Despregamento dunha proteína con SDS. miniatura|Despregamento dunha proteína con calor. A SDS-PAGE é un método electroforético co que se poden separar proteínas pola súa masa. O medio (ou matriz) no que se realiza é un xel descontinuo baseado na poliacrilamida. Ademais úsase o surfactante SDS (dodecil sulfato sódico). A cada gramo de proteína únense uns 1,4 gramos de SDS, o que corresponde a unha molécula de SDS por cada dous aminoácidos da proteína. O SDS actúa como un surfactante, que cobre as proteínas dándolles unha proporción moi similar de carga-masa. As cargas intrínsecas que tiñan as proteínas son desprezables en comparación coas que ten o SDS que as cobre, e as cargas positivas son tamén reducidas no rango de pH básico dun xel separador. Coa aplicación dun campo eléctrico constante, as proteínas migran cara ao ánodo, cada unha cunha diferente mobilidade, dependendo da súa masa. Este procedemento simple permite a separación precisa das proteínas pola masa sen que inflúan as cargas intrínsecas orixinais da proteína.
O SDS tende a formar micelas esféricas en solucións acuosas por riba de certa concentración chamadas concentración micelar crítica (CMC). Por riba dunha concentración micelar crítica de 7 a 10 milimolar en solucións acuosas, o SDS aparece como moléculas separadas (monómero) e como micelas, pero por debaixo da CMC o SDS parece só como monómero en solucións acuosas. Á CMC, unha micela consta dunhas 62 moléculas de SDS. Porén, só os monómeros de SDS se unen a proteínas e fano por medio de interaccións hidrófobas, mentres que as micelas de SDS son aniónicas na parte exterior e non se adsorben a ningunha proteína. O SDS é de natureza anfipática, o que permite que se despreguen tanto os segmentos polares coma non polares da estrutura das proteínas. A concentracións de SDS superiores a 0,1 milimolar, empeza o despregamento das proteínas, e por riba de 1 mM, a maioría das proteínas son desnaturalizadas. Debido ao forte efecto desnaturalizador do SDS e a disociación subseguinte dos complexos proteicos, xeralmente non poden determinarse as estruturas cuaternarias usando SDS. Son excepcións, por exemplo, as proteínas que foron previamente estabilizadas por enlaces cruzados covalentes e os complexos proteicos resistentes ao SDS, que son estables mesmo en presenza de SDS (isto último só a temperatura dunha habitación). Para desnaturalizar os complexos resistentes ao SDS cómpre unha alta enerxía de activación, que se consegue quentando. A resistencia ao SDS está baseada na metaestabilidade do pregamento das proteínas. Aínda que a proteína nativa completamente pregada resistente ao SDS non ten suficiente estabilidade en presenza de SDS, o equilibrio químico da desnaturalización a temperatura dunha habitación ocorre lentamente. Os complexos de proteínas estables caracterízanse non só pola resistencia ao SDS senón tamén pola estabilidade contra as proteases e un incremento da vida media biolóxica.
Alternativamente, a electroforese en xel de poliacrilamida pode realizarse tamén cos surfactantes catiónicos CTAB nunha CTAB-PAGE, ou o 16-BAC nunha BAC-PAGE.
Procedemento O método SDS-PAGE comprende as seguintes etapas: preparación do xel, preparación da mostra, electroforese, tinguidura das proteínas ou western blotting e análise do padrón de bandas xerado.
Produción do xel
miniatura|Peites para mostras con diferente número de petos, cada puga deixa un peto ou pozo no xel ao extraela. miniatura|Xel de concentración e separación polimerizado antes de retirar o peite para mostras (branco) entre os espazadores (negro), no xel de concentración engadíronse cantidades pequenas de azul de bromofenol para mellorar a visibilidade; o xel separador non está tinguido. Cando se usan diferentes tampóns no xel (xel de electroforese descontinuo), os xeles prepáranse un día antes de realizar a electroforese, para que a difusión non orixine unha mestura dos tampóns. O xel prodúcese por polimerización de radicais nun molde que consiste en dúas placas de vidro seladas con espazadores entre as placas de vidro. Nun típico molde de minixel, os espazadores teñen un grosor de 0,75 mm ou 1,5 mm, o cal determina a capacidade de carga do xel. Para verter a solución do xel, as placas son xeralmente suxeitadas cunha abrazadeira que sela temporalmente a parte inferior das placas de vidro (que doutro modo estarían abertas) cos dous espazadores. Para facer a solución do xel mestúrase a acrilamida como formador do xel (usualmente ao 4% V/V no xel de concentración ou stacking e ao 10-12 % no xel separador), a metilenobisacrilamida como axente formador de enlaces cruzados, o tampón do xel separador ou de concentración, a auga e o SDS. Ao engadir o catalizador TEMED e o iniciador de radicais persulfato amónico empeza a polimerización. A solución é despois vertida entre as placas de cristal sen crear burbullas. Dependendo da cantidade de catalizador e iniciador de radicais e dependendo da temperatura, a polimerización dura entre un cuarto de hora e varias horas. O xel inferior (xel separador) vértese primeiro e cóbrese cunhas poucas pingas dun alcohol escasamente hidrosoluble (xeralmente tampón de butanol saturado ou isopropanol), que elimina as burbullas do menisco e protexe a solución do xel do oxíxeno eliminador de radicais. Despois da polimerización do xel separador, o alcohol desbótase e o alcohol residual é eliminado con papel de filtro. Despois da adición do persulfato amónico e o TEMED á solución do xel de concentración (stacking gel), vértese sobre o xel de separación solidificado. Despois, insírese un peite de mostra adecuado entre as placas de cristal sen crear burbullas. O peite de mostras extráese coidadosamente despois da polimerización, deixando petos ou pozos formados para a aplicación da mostra. Para o uso posterior de proteínas para secuenciación de proteínas, os xeles prepáranse a miúdo o día anterior antes da electroforese para reducir as reaccións da acrilamida non polimerizada coas cisteínas nas proteínas.
Usando un mesturador de gradiente, pódense preparar xeles de gradiente cun gradiente de acrilamida (xeralmente do 4 ao 12%), que teñen un rango de separación maior das masas moleculares. Os sistemas de xeles comerciais (denominados xeles pre-moldeado) xeralmente usan o tampón Bis-tris metano cun valor de pH entre 6,4 e 7,2 tanto no xel de concentración coma no separador. Estes xeles entréganse moldeados e listos para usar. Como usan un só tampón (electroforese en xel continua) e teñen un pH case neutro, poden ser almacenados durante varias semanas. O pH máis neutro ralentiza a hidrólise e así a descomposición da poliacrilamida. Ademais, na proteína hai poucas cisteínas que foran modificadas pola acrilamida. Debido ao pH constante nos xeles colector e separador non hai efecto de empillamento (stacking). As proteínas de xeles BisTris non se poden tinguir con complexos de rutenio. Este sistema de xel ten un rango de separación comparativamente grande, que pode variarse usando MES ou MOPS no tampón para correr o xel.
Preparación da mostra
miniatura|Redución de dislfuros polo DTT. Durante a preparación das mostras, o tampón da mostra, e con el o SDS, engádense en exceso con respecto ás proteínas, e a mostra é despois quentada a 95 °C durante cinco minutos, ou alternativamente a 70 °C durante dez minutos. O quentamento altera as estruturas secundaria e terciaria das proteínas ao distorsionar os enlaces de hidróxeno e estirar as moléculas. Opcionalmente, as pontes disulfuro poden ser clivadas por redución. Para este propósito, engádense ao tampón da mostra tiois redutores como o β-mercaptoetanol (β-ME, 5% por volume), ditiotreitol (DTT, 10 milimolar) ou ditioeritritol (DTE, 10 milimolar). Despois de arrefrialo ata a temperatura dunha habitación, cada mostra é pipeteada no seu propio pozo no xel, que foi previamente mergullado no tampón electroforético no aparello de electroforese.
Ademais das mostras, xeralmente cárgase no xel un marcador de tamaño de peso molecular. Este consta de proteínas de tamaños coñecidos e así permite a estimación (cun erro de ± 10%) do tamaño das proteínas nas mostras reais, o cal migra en paralelo en diferentes carreiros do xel. O marcador de tamaño adoita pipetearse no primeiro ou no último dos petos ou pozos do xel.
Electroforese
miniatura|A cámara de electroforese uns poucos minutos despois de iniciada a electroforese. No primeiro peto ou pozo aplícase un marcador de tamaño co azul de bromofenol, nos outros petos, engádese ás mostras verde de bromocresol Para a separación, as mostras desnaturalizadas cárganse nun xel de poliacrilamida, que se sitúa nun tampón electroforético con electrólitos adecuados. Despois aplícase unha voltaxe (xeralmente duns 100 V, 10-20 V por cm de lonxitude do xel), que causa a migración das moléculas cargadas negativamente a través do xel na dirfección do ánodo cargado positivamente. O xel actúa como un baruto. As pequenas proteínas migran de forma relativamente doada a través da rede do xel, mentres que as proteínas máis grandes é máis probable que queden retidas e migren máis lentamente polo xel, o que permite que as proteínas sexan separadas por tamaño molecular. A electroforese tarda entre media hora e varias horas dependendo da voltaxe e a lonxitude do xel usado.
As proteínas que migran máis rápido (cun peso molecular de menos de 5 KDa) forman a fronte do tampón xunto cos compoñentes aniónicos do tampón electroforético, que tamén migra a través do xel. A área da fronte do tampón faise visible ao engadir ao tampón da mostra a tinguidura aniónica comparativamente pequena azul de bromofenol. Debido ao tamaño molecular relativamente pequeno do azul de bromofenol, este migra máis rápido que as proteínas. Facendo un control óptico da banda coloreada migrante, pode pararse a electroforese antes de que a tinguidura e tamén as mostras migren completamente a través do xel e saian del.