Urease

As ureases(), son encimas que funcionalmente pertencen á superfamilia das amidohidrolases e fosfotriesterases.L. Holm, C. Sander, Proteins 28 (1997) 72–82. Son metaloencimas de elevado peso molecular que conteñen níquel. Catalizan a hidrólise da urea a dióxido de carbono e amoníaco mediante a seguinte reacción: (NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3

Máis especificamente, a urease cataliza a hidrólise da urea para producir amoníaco e carbamato, e posteriormente o carbamato se degrada por hidrólise espontánea producindo outra molécula de amoníaco e dióxido de carbono. Por tanto, o dióxido de carbono fórmase en dous pasos. A actividade da urease tende a incrementar o pH (faise máis básico) no medio, xa que produce amoníaco, unha molécula básica. As ureases están presentes en moitas bacterias, fungos, algas, plantas e algúns invertebrados, e tamén en solos, como un encima liberado no solo.

En 1926, James Batcheller Sumner, na Universidade Cornell, demostrou que a urease era unha proteína ao examinar a súa forma cristalizada.Karplus, P. A., Pearson, M. A., & Hausinger, R. P. (1997). 70 years of crystalline urease: What have we learned? Accounts of Chemical Research, 30(8), 330–337 O traballo de Sumner foi a primeira demostración de que unha proteína pura podía funcionar como encima, e o que levou ao recoñecemento de que a maioríaExisten tamén os ribozimas de ARN. dos encimas son proteínas, e valeulle a concesión do Premio Nobel de Química de 1946.The Nobel Prize in Chemistry 1946 A urease foi o primeiro encima que foi cristalizado. A estrutura da urease foi resolta por primeira vez por P. A. Karplus en 1995.

Características No sitio activo deste encima é necesario o níquel na planta Canavalia ensiformis (chamada no Brasil feixón de porco) e en varias bacterias.nickel in biology Porén, a súa activación in vitro tamén se pode conseguir con manganeso e cobalto Masa molecular: 480 kDa ou 545 kDa no caso da urease de Canavalia ensiformis (masa calculada a partir da súa secuencia de aminoácidos). Ten 840 residuos de aminoácidos por molécula, dos cales 90 son cisteínas. pH óptimo: 7,4. Temperatura óptima: 60 °C. Especificidade encimática: urea e hidroxiurea. Inhibidores: metais pesados (Pb- & Pb2+)

As ureases bacterianas están compostas por tres subunidades distintas, unha grande (α de 60–76kDa) e dúas pequenas (β de 8–21 kDa, e γ de 6–14 kDa), que xeralmente teñen unha estequiometría trímera (αβγ)3 cunha estrutura simétrica (nótese que a imaxe de arriba mostra a estrutura da unidade asimétrica, que é un terzo da verdadeira ensamblaxe biolóxica), e son encimas ricos en residuos de cisteína, os cales supoñen no encima unha masa de entre 190 e 300kDa.

Un encima excepcional é a urease das bacterias Helicobacter, que está composta por dúas subunidades, α(26–31 kDa)-β(61–66 kDa), e forma un complexo supramolecular dodecamérico de subunidades repetidas α-β, e cada par acoplado de subunidades ten un sitio activo, cun total de 12 sitios activos (). Exerce unha función esencial para a supervivencia da bacteria, ao neutralizar o ácido gástrico permitindo que a urea entre no periplasma bacteriano por medio dun canal de urea de apertura regulada por protóns. A detección da presenza de urease utilízase para a diagnose das infeccións por Helicobacter pylori.

Todas as ureases bacterianas son exclusivamente citoplasmáticas (intracelulares), agás no caso da urease de H. pylori, que xunto coa súa actividade intracelular, ten unha actividade externa coas células hóspede. Todas as ureases de plantas son citoplasmáticas.

As ureases de fungos e plantas están feitas de subunidades idénticas (de ~90 kDa), normalmente ensambladas en trímeros e hexámeros. Por exemplo, a urease do feixón Canavalia ensiformis ten dúas subunidades estruturais e unha catalítica. A subunidade α contén o sitio activo, está composta por 840 aminoácidos por molécula (con 90 cisteínas), a súa masa molecular sen contar os ións de Ni(II) é de 90,77 kDa. A masa do hexámero cos seus 12 ións níquel é de 545,34 kDa. Está estruturalmente relacionada co trímero (αβγ)3 das ureases bacterianas. Outros exemplos de estruturas homohexaméricas de ureases de plantas son as da soia, das sementes de algodón e da fabácea Cajanus cajan.

Hai que salientar que, aínda que están compostas por distintos tipos de subunidades, as ureases de diferentes fontes, desde as bacterianas ás de plantas e fungos, mostran unha grande homoloxía nas súas secuencias de aminoácidos.

Sitio activo

O sitio activo de todas as ureases coñecidas está situado na subunidade alfa. É un centro de níquel dimérico bis-μ-hidroxo, cunha distancia interatómica de ~3,5 Å; experimentos de susceptibilidade magnética na urease de Canavalia ensiformis indicaron que, os ións de Ni(II) coordinados octaedricamente con alto spin están feblemente acoplados antiferromagneticamente.Coordination Chemistry Reviews 190–192 (1999) 331–355 Os ións níquel están ponteados por unha lisina carbamilada por medio dos seus átomos de oxíxeno e por un ión hidróxido. O Ni(1) está coordinado por átomos de N de residuos de histidinas e unha molécula de auga. Ni(2) está coordinado por dúas histidinas tamén por medio de átomos de N e adicionalmente por ácido aspártico por medio dos seus átomos de O e dúas moléculas de auga. Os estudos de espectroscopía de absorción de raios X (XAS) da urease de Canavalia ensiformis, Klebsiella aerogenes e Sporosarcina pasteurii (antes chamada Bacillus pasteurii) confirman que hai 5–6 ións níquel coordinados exclusivamente con ligandos O/N (dous imidazois por níquel).

As moléculas de auga están localizadas cara á abertura do sitio activo e forman un grupo tetraédrico que enche o sitio da cavidade con enlaces de hidróxeno, e aquí é onde se une a urea ao sitio activo para que teña lugar a reacción, desprazando as moléculas de auga. Os residuos de aminoácidos participan na unión do substrato, principalmente por medio de enlaces de hidróxeno, estabilizan o estado de transición catalítico e aceleran a reacción. Ademais, os residuos de aminoácidos implicados na arquitectura do sitio activo compoñen parte da solapa móbil do sitio, a cal actúa como unha cancela para o substrato. Os residuos de cisteína son comúns na rexión da solapa dos encimas, pero determinouse que non son esenciais na catálise, aínda que están implicados en situar outros residuos claves correctamente no sitio activo. Na estrutura da urease de Sporosarcina pasteurii a solapa encóntrase na súa conformación aberta, e a súa conformación pechada é aparentemente necesaria para a reacción.

Cando se comparan as subunidades α da urease de Helicobacter pylori e outras ureases bacterianas alíñanse coa urease da planta Canavalia ensiformis, o que suxire que todas as ureases son variantes evolutivas dun encima ancestral.

Hai que salientar que a coordinación da urea no sitio activo da urease nunca foi observada no estado de repouso do encima.

Actividade

A kcat/Km da urease no procesamento da urea é 1014 veces maior que a velocidade da reacción de eliminación non catalizada da urea. A proximidade da urea a grupos activos do sitio activo xunto coa correcta orientación da urea permiten que a hidrólise ocorra moi rapidamente. A urea soa (sen a presenza do encima) é moi estable debido ás formas de resonancia que pode adoptar. A estabilidade da urea débese á súa enerxía de resonancia, que foi estimada en 30–40 kcal/mol. Todas as formas de resonancia zwitteriónicas doan electróns ao carbono carbonilo facéndoo menos electrófilo e menos reactivo a un ataque nucleofílico.

Mecanismos propostos

Blakeley/Zerner

Un mecanismo para explicar a catálise desta reacción pola urease foi proposto por Blakely e Zerner. A reacción comeza cun ataque nucleofílico polo oxíxeno do carbonilo da molécula de urea sobre o Ni con coordinación 5 (Ni-1). Un ligando de auga debilmente coordinado é desprazado no seu lugar. Un par solitario de electróns dun dos átomos de nitróxeno da molécula de urea crea un dobre enlace co carbono central, e o NH2+ resultante do substrato coordinado interacciona cun grupo próximo cargado negativamente. Blakeley e Zerner propuxeron que este grupo próximo era un ión carboxilato.

Unha base desprotona un ligando hidróxido no Ni con coordinación 6. O carbono carbonílico sofre seguidamente o ataque dun oxíxeno electronegativo. Un par de electróns do dobre enlace nitróxeno-carbono volve ao nitróxeno e neutraliza a carga que había nel, mentres que o carbono con coordinación 4 adopta unha orientación tetraédrica intermedia.

Na rotura deste intermediario colabora despois un grupo sulfhidrilo dunha cisteína localizada preto do sitio activo do encima. Un hidróxeno enlázase a un dos átomos de nitróxeno, rompendo os seus enlaces co carbono, e liberando unha molécula de NH3. Simultaneamente, rompe o enlace entre o oxíxeno e o Ni con corrdinación 6. Isto deixa un ión carbamato coordinado ao Ni con corrdinación 5, que é despois desprazado por unha molécula de auga, rexenerando o encima.

O carbamato producido degrádase despois espontaneamente para producir outra molécula de amoníaco e ácido carbónico.

Hausinger/Karplus

O mecanismo proposto por Hausinger e Karplus trata de revisar algúns dos problemas que se daban na vía de Blakely e Zerner, e está enfocado ás posicións das cadeas laterais que forman ao peto de unión da urea. Baseándose nas estruturas cristalinas da urease da bacteria Klebsiella aerogenes, considerouse que a base xeral utilizada no mecanismo de Blakely, que era a His320, estaba demasiado lonxe da auga unida ao Ni2 para desprotonarse para formar o residuo de hidróxido atacante. Ademais, non se identificou o ligando ácido xeral que cómpre para protonar o nitróxeno da urea. Hausinger e Karplus suxiren un esquema de protonación inversa, no cal unha forma protonada do ligando His320 xoga o papel do ácido xeral, e a auga unida ao Ni2 está xa no estado desprotonado. O mecanismo segue a mesma vía, pero omite a base xeral (xa que non se necesita), e a His320 doa o seu protón para formar a molécula de amoníaco, que despois se libera do encima. Aínda que a maioría dos ligandos His320 e a auga unida non están nas súas formas activas (protonada e desprotonada, respectivamente), calculouse que aproximadamente o 0,3% do encima urease total estaría sempre activo. Aínda que loxicamente, isto implicaría que o encima non é moi eficiente, en contra do coñecemento establecido que se ten del, o uso do esquema de protonación inversa proporciona unha vantaxe no incremento da reactividade para a forma activa, compensando a desvantaxe. Ao situar o ligando His320 como un compoñente esencial do mecanismo tamén se ten en conta a rexión solapa móbil do encima. Como este ligando histidina forma parte da solapa móbil, a unión do substrato urea para a catálise pecha esta solapa sobre o sitio activo, e coa adición do patrón de enlaces de hidróxeno da urea con outros ligandos no peto, explícase a selectividade do encima pola urea.

Ciurli/Mangani