miniaturadeimagen|Imagen que ilustra el flujo de trabajo de la detección de miARN, estos pueden ser detectados con biosensores complejos como biosensores electroquímicos y biosensores ópticos. Los biosensores de miARN utilizan nanomateriales, elementos de reconocimiento y elementos de amplificación para la detección sensible y específica de miARN. Los biosensores de microARN (miARN) son dispositivos analíticos que implican interacciones entre las cadenas meta de miARN y el elemento de reconocimiento en una plataforma de detección para producir señales que se pueden medir para indicar los niveles o la presencia del miARN meta.
Las investigaciones en torno a los biosensores de microARN demuestran tiempos de lectura más breves, mayor sensibilidad y especificidad de la detección de miARN y costos de fabricación menores a los métodos de detección de miARN convencionales.
Son una categoría pequeña de ARN y no codificante, con una longitud de entre 18 y 25 pares de bases. Los miARN regulan procesos celulares, como la regulación génica a nivel postranscripcional, y se encuentran en abundancia en fluidos corporales como la saliva, la orina y en fluidos circulatorios como la sangre. Se encuentran en animales y plantas codificados en genes individuales y tienen funciones reguladoras que afectan los mecanismos celulares. Están altamente asociados con enfermedades como el cáncer y las enfermedades cardiovasculares. En el cáncer, los miARN desempeñan funciones oncogénicas o de supresión tumoral y son prometedores como biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. Existen diversas técnicas en entornos clínicos y de investigación para analizar biomarcadores de miARN. No obstante, el costo elevado, los requerimientos de tiempo, la formación del personal, la baja sensibilidad y la especificidad en la detección son algunas de las limitaciones inherentes de los métodos actuales que crean la necesidad de mejorar los métodos de detección de miARN.
Antecedentes Se encuentran vinculados a procesos tanto fisiológicos como patológicos. Razón por la cual existe una demanda creciente para su medición en áreas como la salud humana, la agricultura y el análisis ambiental. Estos son algunos aspectos fundamentales que resaltan la necesidad de la detección de miARN:
Biomarcadores potenciales: los miARN presentan una expresión específica en enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades autoinmunes, lo que puede ser beneficioso para la detección temprana, el pronóstico y el seguimiento de la respuesta a los tratamientos.Maydelín, F. N. (2012). MicroRNAs en el cáncer: de la investigación a la práctica clínica. En Revista Cubana de Medicina, 51(4). Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. ISSN 0034-7523. Recuperado de http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-75232012000400006 Asimismo, debido a que los miARN están presentes en fluidos corporales como la orina, la saliva y la sangre, su detección resulta menos invasiva en comparación con técnicas como las biopsias. Por lo cual, resulta más cómodo para los pacientes y puede facilitar un control más frecuente de su enfermedad. Mecanismos moleculares: dado que los miARN tienen funciones reguladoras en la expresión génica y las vías de señalización, su estudio puede aportar información sobre la etiología de enfermedades y su modulación podría ofrecer opciones terapéuticas. Medicina personalizada: dado que la expresión específica de los miARN representa una prometedora estrategia para potenciar la medicina personalizada, ofrecen una comprensión más detallada del riesgo de enfermedad individual, la respuesta al tratamiento y el pronóstico, lo cual ayuda a los médicos a tomar decisiones clínicas mejor fundamentadas.
Historia de la tecnología de la detección de microARN
Métodos de detección temprana y actual El primer miARN (lin-4) fue detectado por Victor Ambros en Caenorhabditis elegans en 1993.El primer método de detección fue la Técnica de Northern Blot (1977), la cual tenía baja sensibilidad. A continuación, se presentó la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (1990), la cual ofrecía una alta sensibilidad de detección.
Técnica de Northern: La técnica de Northern implica hibridar sondas de miARN (secuencias cortas de ácido nucleico) con miARN, para luego ser separadas en un gel y transferencidas a una membrana. Las sondas están marcadas con isótopos radiactivos (lo que plantea problemas de seguridad y ambientales), enzimas o marcadores fluorescentes. La cantidad de ARN presente se infiere de la intensidad de la señal de la sonda. Si bien la técnica de Northern es muy específica y útil para validar métodos de alto rendimiento como la secuencia de ARN, requiere un gran volumen de muestra, consume mucho tiempo y carece de precisión en el análisis de cuantificación. Reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR en tiempo real): este método comienza con la conversión de miARN en ADNc utilizando enzimas transcriptasa inversa. Luego, el ADNc se amplifica utilizando cebadores específicos de secuencia, un proceso monitoreado por colorantes o sondas fluorescentes. La RT-PCR en tiempo real se destaca por su sensibilidad y especificidad. Sin embargo, enfrenta desafíos como la necesidad de estandarización, complejidades técnicas (por ejemplo, diseño de imprimaciones, preparación de muestras), procesos que consumen mucho tiempo y costos elevados.
Métodos de alto rendimiento:
Microarrays (1990): Los microarrays permiten la detección de miles miARN en un solo experimento. Consisten en una superficie sólida a la que se unen secuencias de miARN complementarias. La introducción de miARN les permite unirse a estas sondas con la cantidad de miARN medida por la intensidad de fluorescencia. Los microarrays son rentables en comparación con la RT-PCR y la NGS (por sus siglas en inglés) en tiempo real, pero tienen limitaciones para detectar cantidades bajas de miARN y distinguir entre miARN con secuencias similares. Secuenciación de nueva generación (NGS) (2005): NGS comienza con la extracción de ARN y la transcripción inversa en ADNc, seguida de la ligación y amplificación del adaptador. Luego el ADNc se secuencia en una plataforma NGS, produciendo millones de lecturas cortas. Los bioinformáticos expertos y las herramientas sofisticadas deben alinear y analizar los datos y las lecturas de mapas para hacer referencia a las secuencias de miARN para el descubrimiento y la identificación de miARN. NGS ofrece una alta sensibilidad y especificidad para detectar miARN de baja cantidad e identificar miARN que difieren en un solo nucleótido.
Principios de los biosensores de microARN Tres elementos esenciales que componen los biosensores de miARN:
Elemento de reconocimiento biológico: pueden detectar moléculas específicas meta y tienen diferentes tipos, incluidos anticuerpos, antígenos, ADN/ARN, aptámeros, enzimas y PIMs (polímeros de impresión molecular). Transductor: después del reconocimiento, el transductor es un elemento necesario para convertir los cambios en el elemento de reconocimiento en una señal medible. Según el tipo de señal que producen, se clasifican en transductores electroquímicos, ópticos y mecánicos. Procesador de señales biomédicas: elementos computacionales que amplifican y procesan las señales producidas por los transductores y que pueden demostrarse mediante valores numéricos y lecturas digitales.
Especificidad en la detección de miRNA El término especificidad en el contexto de los biosensores de miARN se refiere a la capacidad del biosensor para identificar un miARN particular dentro de una muestra que contiene varios componentes y miARN con secuencias similares. El desafío para lograr esta especificidad se deriva del pequeño tamaño de los miARN, que pueden diferir entre sí en un solo nucleótido. En consecuencia, es esencial diseñar biosensores capaces de reconocer con precisión el miARN meta.
Sensibilidad en la detección de miRNA La sensibilidad en los biosensores de miARN se refiere a su capacidad para detectar el miARN meta en bajas concentraciones dentro de las muestras. Dado que los miARN se encuentran típicamente en pequeñas cantidades, los biosensores están diseñados para identificar concentraciones tan bajas como los niveles femtomolares (10^-15) o atomolares (10^-18). Obtener esa alta sensibilidad implica mejoras en los elementos de reconocimiento, la amplificación y las técnicas de procesamiento. El límite de detección (LoD) se utiliza para determinar el valor concreto de la sensibilidad en los biosensores, el cual indica la concentración más baja de miARN que se puede separar de la señal de fondo (cero) con un nivel específico de seguridad.
El rango dinámico en los biosensores miARN se refiere a las concentraciones sobre las cuales el biosensor puede detectar con precisión el miARN meta, que se extiende desde el LoD más bajo detectado hasta la máxima concentración que se puede medir sin necesidad de dilución de la muestra.
Tipos de biosensores de microARN
Biosensores electroquímicos miniaturadeimagen|Mecanismo general de un biosensor electroquímico miARN basado en etiquetas. Presentan ventajas significativas para la detección de miARN sobre métodos de análisis de miARN convencionales. El uso de sistemas electrónicos simples reduce los costos de producción y aumenta la facilidad de uso en configuraciones de sistemas portátiles. Esto permite un ámbito de uso más amplio que incluye aplicaciones de análisis ambientales, clínicos y de alimentos.
La detección se basa en medir los cambios en la propiedad del electrodo o la señalización redox del compuesto electroactivo en la transducción de especies reporteras electroquímicamente activas y la hibridación entre el miARN meta y la sonda complementaria. Se pueden crear varios materiales pueden servir de elemento de transducción como plata, oro, grafito o variaciones de nanopartículas de dichos materiales.
Asimismo, la detección de los cambios en las propiedades electroquímicas permite que se realicen análisis en tiempo real y datos cinéticos, una ventaja de la que carecen los métodos de biosensores, como los biosensores ópticos. La contaminación de luz no es una limitación de biosensores electroquímicos de miARN.
Sin embargo, se requieren técnicas como la amplificación del círculo rodante (ACR) cuando las concentraciones de miARN son insuficientes para producir una señal eléctrica.
1. Biosensores electroquímicos voltamperométricos y amperométricos Los biosensores electroquímicos miARN se pueden diseñar para deducir medidas voltamperométricas o amperométricas. En cuanto a la hibridación del miARN meta con su secuencia de sonda complementaria, los biosensores voltamperométricos de miARN detectan el cambio de corriente basado en un aumento o disminución controlada del potencial eléctrico en la plataforma de detección. Los biosensores amperométricos detectan el cambio en la corriente eléctrica en un potencial eléctrico positivo fijo.Los desarrollos recientes en biosensores de miARN voltamperométricos y amperométricos se pueden clasificar como biosensores basados en etiquetas o sin etiquetas en el propósito, lo que indica si se utilizan o no etiquetas electroactivas de miARN como su nombre lo sugiere.
Biosensores miARN voltamperométricos y amperométricos libres de etiquetas (detección directa)