miniaturadaimagem|Dinâmica dos grânulos de estresse. Em biologia celular, os grânulos de estresse são condensados biomoleculares no citosol compostos de proteínas e RNA que se agrupam em organelas sem membrana de 0,1–2 μm quando a célula está sob estresse. As moléculas de mRNA encontradas nos grânulos de estresse são complexos de pré-iniciação de tradução paralisados associados a subunidades ribossômicas 40S, fatores de iniciação de tradução, mRNA poli(A)+ e proteínas de ligação a RNA (RBPs). Embora sejam organelas sem membrana, os grânulos de estresse foram propostos como associados ao retículo endoplasmático. Há também grânulos de estresse nuclear. Este artigo é sobre a variedade citosólica.
Funções propostas A função dos grânulos de estresse permanece em grande parte desconhecida. Há muito tempo que se propõe que os grânulos de estresse tenham a função de proteger o RNA de condições prejudiciais, daí seu aparecimento sob estresse. O acúmulo de RNA em glóbulos densos pode impedi-los de reagir com substâncias químicas nocivas e proteger as informações codificadas em sua sequência de RNA.
Os grânulos de estresse também podem funcionar como um ponto de decisão para mRNA não traduzido. As moléculas podem seguir um de três caminhos: armazenamento adicional, degradação ou reinício da tradução. Por outro lado, também foi argumentado que os grânulos de estresse não são locais importantes para o armazenamento de mRNA, nem servem como um local intermediário para o mRNA em trânsito entre um estado de armazenamento e um estado de degradação.
Os esforços para identificar todo o RNA dentro dos grânulos de estresse (o transcriptoma do grânulo de estresse) de forma imparcial, por meio do sequenciamento do RNA de "núcleos" de grânulos de estresse purificados bioquimicamente, mostraram que o RNA não é recrutado para os grânulos de estresse de maneira específica da sequência, mas sim genericamente, com transcrições mais longas e/ou traduzidas de forma menos otimizada sendo enriquecidas. Esses dados implicam que o transcriptoma do grânulo de estresse é influenciado pela valência do RNA (para proteínas ou outro RNA) e pelas taxas de escoamento de RNA dos polissomos. Este último é ainda apoiado por estudos recentes de imagens de moléculas únicas. Além disso, estimou-se que apenas cerca de 15% do mRNA total na célula está localizado nos grânulos de estresse, sugerindo que os grânulos de estresse influenciam apenas uma minoria do mRNA na célula e podem não ser tão importantes para o processamento do mRNA como se pensava anteriormente. Dito isto, esses estudos representam apenas um instantâneo no tempo, e é provável que uma fração maior de mRNA seja armazenada em algum momento em grânulos de estresse devido ao trânsito de RNA para dentro e para fora.
As proteínas de estresse que são o principal componente dos grânulos de estresse nas células vegetais são chaperonas moleculares que sequestram, protegem e possivelmente reparam proteínas que se desdobram durante o calor e outros tipos de estresse. Portanto, qualquer associação de mRNA com grânulos de estresse pode ser simplesmente um efeito colateral da associação de proteínas de ligação a RNA parcialmente desdobradas com grânulos de estresse, semelhante à associação de mRNA com proteassomas.
Danos ao RNA DHX9 é um grânulo de estresse distinto que possui atividade helicase capaz de atuar no RNA fita dupla, mas não no DNA, para promover a sobrevivência celular. DHX9 atua como um compartimento citoplasmático não ligado à membrana para proteger as células-filhas de danos ao RNA parental. A montagem dos grânulos de estresse DHX9 parece ser um mecanismo dedicado em células de mamíferos para proteção contra danos de reticulação de RNA.
Formação Estressores ambientais desencadeiam a sinalização celular, levando eventualmente à formação de grânulos de estresse. In vitro, esses estressores podem incluir calor, frio, estresse oxidativo (arsenito de sódio), estresse do retículo endoplasmático (tapsigargina), inibição do proteassoma (MG132), estresse hiperosmótico, radiação ultravioleta, inibição de eIF4A (pateamina A, hippuristanol ou RocA), acúmulo de óxido nítrico após tratamento com 3-morfolinosidnonimina (SIN-1), perturbação do splicing pré-mRNA, e outros estressores, como a puromicina, que resultam em polissomos desmontados. Muitos desses estressores resultam na ativação de cinases específicas associadas ao estresse (HRI, PERK, PKR e GCN2), inibição translacional e formação de grânulos de estresse. Os grânulos de estresse também se formarão após a ativação de Gαq em um mecanismo que envolve a liberação de proteínas associadas aos grânulos de estresse da população citosólica da fosfolipase C β efetora de Gαq.
A formação de grânulos de estresse ocorre frequentemente a jusante da fosforilação ativada por estresse do fator de iniciação da tradução eucariótica eIF2α; isso não é válido para todos os tipos de estressores que induzem grânulos de estresse, por exemplo, a inibição de eIF4A. Mais a jusante, a agregação semelhante a um príon da proteína TIA-1 promove a formação de grânulos de estresse. O termo semelhante a príon é usado porque a agregação de TIA-1 é dependente da concentração, inibida por chaperonas e porque os agregados são resistentes às proteases. Também foi proposto que os microtúbulos desempenham um papel na formação de grânulos de estresse, talvez transportando componentes dos grânulos. Esta hipótese baseia-se no fato de que a ruptura dos microtúbulos com o produto químico nocodazol bloqueia o aparecimento dos grânulos. Além disso, muitas moléculas de sinalização demonstraram regular a formação ou a dinâmica dos grânulos de estresse; estas incluem a proteína quinase ativada por AMP (AMPK) do "sensor mestre de energia", a enzima O-GlcNAc transferase (OGT) e a quinase pró-apoptótica ROCK1.
Possíveis papéis das interações RNA-RNA Transições de fase do RNA conduzidas em parte por interações intermoleculares RNA-RNA podem desempenhar um papel na formação de grânulos de estresse. Semelhante às proteínas intrinsecamente desordenadas, os extratos de RNA total são capazes de sofrer separação de fase em condições fisiológicas in vitro. As análises de RNA-seq demonstram que esses conjuntos compartilham um transcriptoma amplamente sobreposto com grânulos de estresse, com o enriquecimento de RNA em ambos sendo predominantemente baseado no comprimento do RNA. Além disso, os grânulos de estresse contêm muitas helicases de RNA, incluindo as helicases DEAD/H-box Ded1p/DDX3, eIF4A1 e RHAU. Na levedura, os alelos mutantes catalíticos ded1 dão origem a grânulos de estresse constitutivos. Os alelos mutantes DDX3X (o homólogo mamífero de Ded1) deficientes em ATPase são encontrados no meduloblastoma pediátrico e coincidem com conjuntos granulares constitutivos em células de pacientes. Essas proteínas DDX3 mutantes promovem a montagem de grânulos de estresse em células HeLa. Em células de mamíferos, os mutantes RHAU levam à redução da dinâmica dos grânulos de estresse. Assim, alguns levantam a hipótese de que a agregação de RNA facilitada pelas interações intermoleculares RNA-RNA desempenha um papel na formação de grânulos de estresse, e que esse papel pode ser regulado por helicases de RNA. Há também evidências de que o RNA dentro dos grânulos de estresse é mais compactado, comparado ao RNA no citoplasma, e que o RNA é modificado pós-traducionalmente pela N6-metiladenosina (m6A) em suas extremidades 5' ou acetilação do RNA ac4C. Trabalhos recentes mostraram que o fator de iniciação da tradução altamente abundante e a proteína DEAD-box eIF4A limitam a formação de grânulos de estresse. Ele faz isso por meio de sua capacidade de ligar ATP e RNA, agindo de forma análoga às chaperonas de proteínas como Hsp70.
Conexão com órgãos de processamento Grânulos de estresse e corpos P (corpos de processamento) compartilham componentes de RNA e proteína, ambos aparecem sob estresse e podem se associar fisicamente uns aos outros. Em 2018, das ~660 proteínas identificadas como localizadas em grânulos de estresse, ~11% também foram identificadas como proteínas de processamento localizadas no corpo (veja abaixo). A proteína G3BP1 é necessária para o encaixe adequado dos corpos de processamento e dos grânulos de estresse entre si, o que pode ser importante para a preservação do mRNA poliadenilado.
Embora alguns componentes proteicos sejam compartilhados entre os grânulos de estresse e os corpos de processamento, a maioria das proteínas em qualquer uma das estruturas são localizadas exclusivamente em cada uma delas. Embora tanto os grânulos de estresse quanto os corpos P estejam associados ao mRNA, os corpos de processamento têm sido há muito propostos como locais de degradação do mRNA porque contêm enzimas como DCP1/2 e XRN1 que são conhecidas por degradar o mRNA. No entanto, outros demonstraram que o mRNA associado aos corpos de processamento são amplamente reprimidos na tradução, mas não degradados. Também foi proposto que o mRNA selecionado para degradação seja passado dos grânulos de estresse para os corpos de processamento, embora também existam dados sugerindo que os corpos de processamento precedem e promovem a formação dos grânulos de estresse.
Composição proteica dos grânulos de estresse O proteoma completo dos grânulos de estresse ainda é desconhecido, mas esforços foram feitos para catalogar todas as proteínas que foram experimentalmente demonstradas transitando para os grânulos de estresse. Importantemente, diferentes estressores podem resultar em grânulos de estresse com diferentes componentes proteicos. Muitas proteínas associadas aos grânulos de estresse foram identificadas por meio do estresse transitório de células cultivadas e utilizando microscopia para detectar a localização de uma proteína de interesse, seja expressando essa proteína fundida a uma proteína fluorescente (ou seja, proteína fluorescente verde (GFP)) e/ou fixando células e usando anticorpos para detectar a proteína de interesse junto com marcadores de proteína conhecidos dos grânulos de estresse (imunocitoquímica).
Em 2016, "núcleos" de grânulos de estresse foram identificados experimentalmente e então purificados bioquimicamente pela primeira vez. As proteínas nos núcleos foram identificadas de maneira imparcial usando espectrometria de massa. Este avanço técnico levou à identificação de centenas de novas proteínas localizadas em grânulos de estresse.
O proteoma dos grânulos de estresse também foi determinado experimentalmente usando duas abordagens de marcação de proximidade ligeiramente diferentes. Uma dessas abordagens de rotulagem de proximidade é o método da ascorbato peroxidase (APEX), no qual as células são projetadas para expressar uma proteína de grânulo de estresse conhecida, como G3BP1, fundida a uma enzima ascorbato peroxidase modificada chamada APEX. Após a incubação das células em biotina e o tratamento das células com peróxido de hidrogênio, a enzima APEX será brevemente ativada para biotinilar todas as proteínas próximas à proteína de interesse, neste caso G3BP1 dentro de grânulos de estresse. Proteínas biotiniladas podem então ser isoladas via estreptavidina e identificadas usando espectrometria de massa. A técnica APEX foi usada para identificar ~260 proteínas associadas a grânulos de estresse em vários tipos de células, incluindo neurônios, e com vários estressores. Das 260 proteínas identificadas neste estudo, ~143 não tinham sido previamente demonstradas como associadas a grânulos de estresse.