miniatura|O complexo promotor da anáfase (APC) é um grande complexo proteico contendo 11 a 13 subunidades, incluindo uma subunidade RING (Apc11) e uma culina (Apc2). A atividade da APC requer a associação com subunidades ativadoras (Cdc20 ou Cdh1) que contribuem para a ligação ao substrato.
O complexo promotor de anáfase ou ciclossoma, também designado, pelo seu acrónimo, APC ou APC/C (Complexo Promotor de Anáfase/Ciclossoma), é uma E3 ubiquitina ligase que marca as proteínas alvo do ciclo celular para degradação no proteossoma de 26S. O APC/C é um grande complexo de 11 a 13 proteínas subunidade, entre as quais se encontram uma culina (Apc2) e a subunidade RING (Apc11) semelhante ao complexo SCF. Outras partes do APC/C têm funções desconhecidas, mas são altamente conservadas.
A descoberta do APC/C (e do SCF) e o seu papel fundamental na regulação do ciclo celular eucariótico estabeleceram a importância da proteólise mediada pela ubiquitina na biologia celular. A ubiquitinação e a subsequente degradação de proteínas pelo proteossoma, anteriormente percebida como um sistema envolvido exclusivamente na remoção de proteínas danificadas da célula, é hoje considerada um mecanismo regulador universal para a transdução de sinal, cuja importância se aproxima da da fosforilação de proteínas.
Em 2014, o APC/C foi mapeado em 3D com uma resolução inferior a um nanómetro, o que serviu também para descobrir a sua estrutura secundária. Esta descoberta pode melhorar a nossa compreensão do cancro e revelar novos locais de ligação para futuros medicamentos anticancerígenos.
Função miniatura|A atividade M–Cdk promove os eventos da mitose inicial, que resultam no alinhamento da metáfase das cromátides irmãs no fuso. A atividade de M–Cdk também promove a ativação de APCCdc20, que desencadeia a anáfase e a saída da mitose ao estimular a destruição de proteínas reguladoras, como a securina e as ciclinas, que governam estes eventos. Ao promover a destruição de ciclinas e, portanto, a inativação de Cdk, o APCCdc20 desencadeia também a ativação de APCCdh1, garantindo assim a atividade contínua de APC na fase G1.
A principal função do APC/C é desencadear a transição da metáfase para a anáfase através da marcação de proteínas específicas para degradação. Os três principais alvos para a degradação da APC/C são a securina e as ciclinas S e M. A securina liberta separase, uma protease, quando é degradada. De seguida, a separase desencadeia o corte ou clivagem da coesina, o complexo proteico que mantém as cromátides irmãs unidas. Durante a metáfase, as cromátides irmãs estão ligadas entre si por complexos de coesina intactos. Quando a securina sofre ubiquitinação pelo APC/C e liberta separase, que degrada a coesina, as cromátides irmãs ficam livres para se deslocarem para pólos opostos do fuso na anáfase. A APC/C tem também como alvo a degradação das ciclinas mitóticas, resultando na inativação de M-CDK (complexos de cinase dependente de ciclina mitótica), promovendo a saída da mitose e da citocinese.
Ao contrário do SCF, várias subunidades ativadoras controlam o APC/C. A Cdc20 e a Cdh1 são dois ativadores de particular importância para o ciclo celular. Estas proteínas ativam o APC/C contra conjuntos específicos de substratos em diferentes momentos do ciclo celular, o que faz com que o ciclo progrida. A APC/C desempenha também um papel integral na manutenção do metabolismo da cromatina, especialmente nas fases G1 e G0, e desempenha um papel fundamental na fosforilação da histona H3 através da destruição da aurora A quinase.
Os substratos críticos do APC/C parecem ser a securina e as ciclinas do tipo B. Isto é conservado entre mamíferos e leveduras. De facto, uma levedura é viável na ausência do APC/C se a necessidade de atacar estes substratos for eliminada.
Subunidades
Não há muita investigação sobre as subunidades do APC/C, que funcionam principalmente como adaptadores. Os estudos de subunidades de APC são conduzidos principalmente em leveduras, e estes estudos mostram que a maioria das subunidades de APC de leveduras também estão presentes em vertebrados; isto sugere a conservação de subunidades em eucariotas. Foram encontradas onze subunidades principais do APC em vertebrados e treze em leveduras. As subunidades activadoras ligam-se ao APC em várias fases do ciclo celular para controlar a sua actividade de ubiquitinação, geralmente direccionando o APC para substratos alvo destinados à ubiquitinação. Foi proposto que a especificidade das ligases APC é controlada pela incorporação de fatores de especificidade no complexo da ligase, em vez da fosforilação do substrato. A subunidade CDC20 permite que o APC degrade substratos como os inibidores da anáfase (Pdsp1) no início da anáfase; Por outro lado, quando o CDC20 é substituído pelo fator de especificidade Hct1, o APC degrada um conjunto diferente de substratos, particularmente as ciclinas mitóticas na anáfase tardia. Os ativadores CDC20 e Cdh1 são de particular importância e são as subunidades mais amplamente estudadas e comuns do APC/C.
O centro catalítico do APC/C é constituído pela subunidade cullina Apc2 e pela subunidade do domínio RING H2 Apc11. Estas duas subunidades catalisam a ubiquitinação de substratos quando o domínio C-terminal de Apc2 forma um complexo fortemente ligado com Apc11. RING/APc11 liga-se ao conjugado E2-ubiquitina que catalisa a transferência de ubiquitina para um sítio activo E2. Para além da funcionalidade catalítica, outras proteínas no centro do complexo APC são compostas por múltiplos motivos repetidos com o propósito principal de fornecer suporte de estrutura molecular. Isto inclui a Apc1, a maior subunidade contendo 11 repetições em tandem de sequências de 35–40 aminoácidos, e a Apc2, que contém três repetições de culina de aproximadamente 130 aminoácidos no total. Os principais motivos nas subunidades de APC incluem motivos tetratricopeptídicos (TPR) e repetições WD40. As regiões C-terminais de CDC20 e Cdh1 têm um domínio WD40 que é sugerido para formar uma plataforma de ligação que se liga a substratos de APC, contribuindo assim para a capacidade de APC de atacar estes substratos, embora o mecanismo exato pelo qual este aumento na atividade da APC ocorre seja desconhecido. Foi também sugerido que variações nestes domínios WD40 resultam em variações na especificidade do substrato, o que foi confirmado em estudos recentes que indicam que diferentes substratos de APC podem ligar-se direta e especificamente a Cdc20 e Cdh1/Hct1. Por fim, as diferenças na especificidade são responsáveis pela ordem e pelo momento da destruição de vários alvos de APC durante a mitose, de modo que o CDC20 ataca alguns substratos principais na metáfase e o Cdh1 ataca um conjunto mais amplo de substratos no final da mitose e na fase G1.
As 4 subunidades do APC/C da levedura consistem inteiramente em múltiplas repetições do motivo tetratricopeptídico (TPR) de 34 resíduos de aminoácidos. Estas subunidades TPR, Cdc16, Cdc27,Cdc23 e Apc5 fornecem principalmente uma estrutura e suporte para interações proteína-proteína mediadas por outros. Cdc27 e Cdc23 suportam a ligação de Cdc20 e Cdh1, uma vez que as mutações em resíduos chave destas subunidades causam um aumento da dissociação dos ativadores. Apc10/Doc1 promove a ligação do substrato através da mediação das suas interações com Cdh1 e Cdc20.
Especificamente, o CDC20 (também designado p55CDC, Fizzy ou Slp1) inativa o CDK1 através da ubiquitinação das ciclinas do tipo B. Isto resulta na ativação do Cdh1 (também designado por Fizzy-related, Hct1, Ste9 ou Srw1), que interage com o APC durante a mitose tardia e G1/G0. O Cdh1 é inativado por fosforilação durante as fases S, G2 e M inicial. Durante estes momentos do ciclo, não pode ser montado.
APC 3 e APC7 servem para recrutar Cdh1 no complexo promotor da anafase. Isto reforça também que o Cdh1 é responsável pela manutenção da atividade do APC durante o G1. O Cdh1 não requer que o APC seja fosforilado e se ligue; na verdade, a fosforilação do Cdh1 pelas Cdks impede que este se ligue ao APC da fase S para a fase M. Com a destruição do M-Cdk, a libertação do CDC20 do APC e a ligação do Cdh1 podem agora ocorrer, permitindo que a atividade do APC continue durante a entrada em G1. Enquanto o Cdh1 reconhece as ciclinas M e S, permitindo a sua destruição até que toda a célula esteja determinada a avançar para um novo ciclo, não reconhece as ciclinas G1/S e, durante a fase G1/S, a atividade da ciclina pode aumentar livremente e fosforilar, e assim inativar, Cdh1 e, portanto, a APC.
A subunidade Apc15 desempenha um papel importante na ativação de APC/CCdc20 após biorientação da cromátide irmã na placa metafásica. Quando os cinetócoros não estão ligados ao fuso, os complexos de ponto de verificação mitótico (MCCs) inibem o APC. Na ausência de Apc15, os MCCs e o Cdc20 permanecem bloqueados no APC/C, impedindo a sua atividade quando os requisitos do ponto de verificação do fuso são cumpridos. O Apc15 medeia a rotatividade do Cdc20 e dos MCCs para fornecer informações sobre o estado de fixação do cinetócoro.
CDC27/APC3 Uma das subunidades que exibe o motivo TPR, CDC27, demonstrou interagir com proteínas de ponto de verificação mitótico, como Mad2, p55CDC e BUBR1, indicando que pode estar envolvida na sincronização de eventos na fase M."Gene Entrez: homólogo do ciclo de divisão celular 27 de CDC27 (S. cerevisiae)". Existem evidências de que CDC27 faz parte de um complexo ternário com SMAD2/3 e Cdh1, que é formado em resposta à sinalização de TGFβ. Devido à sua interação com o Cdh1 em particular, tem um possível papel na determinação da afinidade entre o APC e os seus ativadores Cdc20 e Cdh1. Um estudo sugere que a fosforilação de Cdc27 induzida por TGF-β aumenta a interação entre Cdc27 e Cdh1, que está diretamente envolvida na ativação de APC. Os substratos críticos do APC/C parecem ser a securina e as ciclinas do tipo B. Isto é conservado entre mamíferos e leveduras. De facto, uma levedura é viável na ausência de APC/C se a necessidade de atacar estes substratos for eliminada.
CDC23, CDC16, CDC27 A CDC23, outra subunidade contendo TPR, interage com a SWM1, ligando-se à caixa D da CLB2. Com base em ensaios híbridos in vivo e co-imunoprecipitação in vitro, foi sugerido que Cdc16p, Cdc23p e Cdc27p (análogos em Saccharomyces cerevisiae) interagem e formam um complexo macromolecular. Foi observado que o seu tema comum de TPR medeia estas interações. Quanto ao Cdc27 e Cdc16 em Drosophila, as suas funções foram testadas por ARN interferente (RNAi). Os resultados sugerem que podem mediar a atividade de todo o complexo por diferentes mecanismos em diferentes locais. Noutros estudos em Drosophila, Cdk16 e Cdk23 parecem ser activadas pela fosforilação da cinase 1 semelhante à Polo (Plk1), e a molécula correspondente da levedura de fissão parece ligar-se especificamente à Cdc23.
O complexo é regulado pelos ativadores CDC20 e Cdh1 durante a mitose. O seu papel na degradação da ciclina B é demonstrado por um rastreio de mutantes de Saccharomyces cerevisiae defeituosos para a degradação da ciclina B, que apresentam mutações nos genes CDC16 e CDC23. Nos mutantes para CDC27, CDC23 e CDC 27, a paragem do ciclo celular ocorre em todos os casos na metáfase.
Reconhecimento de Substrato