ligação=https://en.wikipedia.org/wiki/File:DNAgel4wiki.png|direita|miniaturadaimagem|345x345px|Imagem digital de 3 testes de restrição de plasmídeo executadas em um gel de agarose a 1% p/v, 3 volt/cm, corado com brometo de etídio. O marcador de tamanho de DNA é uma escada comercial de 1 kb. A posição dos poços e a direção da migração do DNA são anotadas. A eletroforese em gel de agarose é um método de eletroforese em gel usado em bioquímica, biologia molecular, genética e química clínica para separar uma população mista de macromoléculas, como DNA ou proteínas, em uma matriz de agarose, um dos dois principais componentes do ágar. As proteínas podem ser separadas por carga e/ou tamanho (a eletroforese em agarose com focalização isoelétrica é essencialmente independente do tamanho), e os fragmentos de DNA e RNA por comprimento. As biomoléculas são separadas pela aplicação de um campo elétrico para mover as moléculas carregadas através de uma matriz de agarose, e as biomoléculas são separadas por tamanho nessa matriz.Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.
O gel de agarose é fácil de moldar, tem relativamente menos grupos carregados e é particularmente adequado para separar o DNA da faixa de tamanho mais frequentemente encontrada em laboratórios, o que explica a popularidade de seu uso. O DNA separado pode ser visualizado com corante, mais comumente sob luz UV, e os fragmentos de DNA podem ser extraídos do gel com relativa facilidade. A maioria dos géis de agarose usados são de 0,7 a 2% dissolvidos em um tampão de eletroforese adequado.
Propriedades do gel de agarose ligação=https://en.wikipedia.org/wiki/File:Two_percent_Agarose_Gel_in_Borate_Buffer_cast_in_a_Gel_Tray_(Front,_angled).jpg|direita|miniaturadaimagem|Um gel de agarose moldado em uma bandeja, a ser usado para eletroforese em gel O gel de agarose é uma matriz tridimensional formada por moléculas helicoidais de agarose em feixes superenrolados que são agregados em estruturas tridimensionais com canais e poros pelos quais as biomoléculas podem passar. A estrutura tridimensional é mantida unida por ligações de hidrogênio e, portanto, pode ser rompida pelo aquecimento até o estado líquido. A temperatura de fusão é diferente da temperatura de gelificação, dependendo das fontes, o gel de agarose tem uma temperatura de gelificação de 35-42 °C e uma temperatura de fusão de 85-95 °C. Também estão disponíveis agaroses de baixo ponto de fusão e de baixa gelificação feitas por meio de modificações químicas.
O gel de agarose tem poros grandes e boa força de gel, o que o torna adequado como meio anticonvecção para a eletroforese de DNA e moléculas grandes de proteína. O tamanho do poro de um gel a 1% foi estimado entre 100 nm e 200-500 nm, e sua força de gel permite que géis tão diluídos quanto 0,15% formem uma placa para eletroforese em gel. Entretanto, géis de baixa concentração (0,1-0,2%) são frágeis e, portanto, difíceis de manusear. O gel de agarose tem um poder de resolução menor do que o gel de poliacrilamida para o DNA, mas tem uma faixa maior de separação e, portanto, é usado para fragmentos de DNA com tamanho de 50 a 20.000 pb. O limite de resolução da eletroforese em gel de agarose padrão é de cerca de 750 kb, mas é possível obter uma resolução de mais de 6 Mb com a eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Também pode ser usado para separar proteínas grandes e é a matriz preferida para a eletroforese em gel de partículas com raios efetivos maiores que 5-10 nm. Um gel de agarose a 0,9% tem poros grandes o suficiente para a entrada do bacteriófago T4.
O polímero de agarose contém grupos carregados, especialmente piruvato e sulfato. Esses grupos carregados negativamente criam um fluxo de água na direção oposta ao movimento do DNA em um processo chamado eletroendosmose (EEO) e, portanto, podem retardar o movimento do DNA e causar borrões nas bandas. Os géis de concentração mais alta teriam um fluxo eletroendosmótico maior. Portanto, a agarose com baixo teor de EEO é geralmente preferida para uso na eletroforese de ácidos nucleicos em gel de agarose, mas a agarose com alto teor de EEO pode ser usada para outros fins. O menor teor de sulfato da agarose de baixo EEO, especialmente da agarose de baixo ponto de fusão (LMP), também é benéfico nos casos em que o DNA extraído do gel deve ser usado para manipulação posterior, já que a presença de sulfatos contaminantes pode afetar alguns procedimentos subsequentes, como a ligação e a PCR. No entanto, as agaroses com zero EEO são indesejáveis para algumas aplicações, pois podem ser feitas com a adição de grupos carregados positivamente e esses grupos podem afetar as reações enzimáticas subsequentes. A eletroendosmose é um motivo pelo qual a agarose é usada em vez do ágar, pois o componente de agaropectina no ágar contém uma quantidade significativa de sulfato carregado negativamente e grupos carboxila. A remoção da agaropectina na agarose reduz substancialmente a EEO, além de reduzir a adsorção não específica de biomoléculas à matriz do gel. No entanto, para algumas aplicações, como a eletroforese de proteínas séricas, pode ser desejável uma alta EEO, e a agaropectina pode ser adicionada ao gel usado.
Migração de ácidos nucleicos em gel de agarose Fatores que afetam a migração de ácido nucleico em gel ligação=https://en.wikipedia.org/wiki/File:Plasmid_miniprep.jpg|miniaturadaimagem|280x280px|Os géis de preparações de plasmídeo geralmente mostram uma banda principal de DNA superenrolado com outras bandas mais fracas na mesma faixa. Observe que, por convenção, o gel de DNA é exibido com fragmentos menores de DNA mais próximos da parte inferior do gel. Isso ocorre porque, historicamente, os géis de DNA eram executados verticalmente e os fragmentos menores de DNA se movem para baixo mais rapidamente Diversos fatores podem afetar a migração dos ácidos nucleicos: a dimensão dos poros do gel (concentração do gel), o tamanho do DNA que está sendo eletroforeseado, a voltagem usada, a força iônica do tampão e a concentração do corante intercalante, como o brometo de etídio, se usado durante a eletroforese.
As moléculas menores se deslocam mais rapidamente do que as moléculas maiores no gel, e o DNA de fita dupla se desloca a uma taxa que é inversamente proporcional ao logaritmo do número de pares de bases. No entanto, essa relação se rompe com fragmentos de DNA muito grandes, e a separação de fragmentos de DNA muito grandes requer o uso de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), que aplica corrente alternada de diferentes direções e os fragmentos grandes de DNA são separados à medida que se reorientam com a mudança de campo.
Para a eletroforese em gel de agarose padrão, as moléculas maiores são melhor resolvidas usando um gel de baixa concentração, enquanto as moléculas menores se separam melhor em um gel de alta concentração. Entretanto, os géis de concentração mais alta exigem tempos de execução mais longos (às vezes, dias).
O movimento do DNA pode ser afetado pela conformação da molécula de DNA; por exemplo, o DNA superenrolado geralmente se move mais rápido do que o DNA relaxado porque é firmemente enrolado e, portanto, mais compacto. Em uma preparação normal de DNA de plasmídeo, várias formas de DNA podem estar presentes. A eletroforese em gel dos plasmídeos normalmente mostra a forma negativamente superenrolada como a banda principal, enquanto o DNA cortado (forma circular aberta) e a forma circular fechada relaxada aparecem como bandas menores. A taxa de movimentação das várias formas, entretanto, pode mudar com o uso de diferentes condições de eletroforese, e a mobilidade do DNA circular maior pode ser mais fortemente afetada do que a do DNA linear pelo tamanho do poro do gel.
O brometo de etídio, que se intercala no DNA circular, pode alterar a carga, o comprimento e a super-helicidade da molécula de DNA, portanto, sua presença no gel durante a eletroforese pode afetar seu movimento. Por exemplo, a carga positiva do brometo de etídio pode reduzir o movimento do DNA em 15%. A eletroforese em gel de agarose pode ser usada para resolver o DNA circular com diferentes topologias de superenrolamento.
O dano ao DNA devido ao aumento da reticulação polimérica também reduzirá a migração eletroforética do DNA de forma dependente da dose.
A taxa de migração do DNA é proporcional à voltagem aplicada, ou seja, quanto maior a voltagem, mais rápido o DNA se move. No entanto, a resolução de fragmentos grandes de DNA é menor em alta voltagem. A mobilidade do DNA também pode mudar em um campo instável - em um campo que é periodicamente revertido, a mobilidade do DNA de um determinado tamanho pode cair significativamente em uma determinada frequência de ciclagem. Esse fenômeno pode resultar em inversão de banda na eletroforese em gel de inversão de campo (FIGE), em que os fragmentos maiores de DNA se movem mais rapidamente do que os menores.
Anomalias de migração Géis "Smiley" - esse efeito de borda é causado quando a tensão aplicada é muito alta para a concentração de gel usada. Sobrecarga de DNA - a sobrecarga de DNA reduz a velocidade de migração dos fragmentos de DNA. Contaminação - a presença de impurezas, como sais ou proteínas, pode afetar o movimento do DNA.
Mecanismo de migração e separação A carga negativa de sua estrutura de fosfato move o DNA em direção ao ânodo carregado positivamente durante a eletroforese. No entanto, a migração das moléculas de DNA em solução, na ausência de uma matriz de gel, é independente do peso molecular durante a eletroforese. A matriz de gel é, portanto, responsável pela separação do DNA por tamanho durante a eletroforese, e existem vários modelos para explicar o mecanismo de separação de biomoléculas na matriz de gel. Um modelo amplamente aceito é o de Ogston, que trata a matriz de polímero como uma peneira. Uma proteína globular ou uma bobina aleatória de DNA se move através dos poros interconectados, e o movimento de moléculas maiores tem maior probabilidade de ser impedido e retardado por colisões com a matriz do gel, e as moléculas de tamanhos diferentes podem, portanto, ser separadas nesse processo de peneiração.
O modelo de Ogston, no entanto, não funciona para moléculas grandes, pois os poros são significativamente menores do que o tamanho da molécula. Para moléculas de DNA de tamanho superior a 1 kb, um modelo de reptação (ou suas variantes) é mais comumente usado. Esse modelo pressupõe que o DNA pode se arrastar de forma "serpenteada" (daí o termo "reptação") pelos poros como uma molécula alongada. Um modelo de reptação tendenciosa se aplica a uma força de campo elétrico mais alta, em que a extremidade principal da molécula se torna fortemente tendenciosa na direção para a frente e puxa o restante da molécula. A microscopia de fluorescência em tempo real de moléculas coradas, no entanto, mostrou uma dinâmica mais sutil durante a eletroforese, com o DNA mostrando uma elasticidade considerável ao se esticar alternadamente na direção do campo aplicado e depois se contrair em uma bola, ou se enganchar em forma de U quando fica preso nas fibras de polímero.
Procedimento geral Os detalhes de um experimento de eletroforese em gel de agarose podem variar dependendo dos métodos, mas a maioria segue um procedimento geral. nenhum|miniaturadaimagem|Vídeo mostrando a montagem do equipamento e o carregamento/execução do gel
Preparo do gel ligação=https://en.wikipedia.org/wiki/File:Loading_DNA_samples_into_an_agarose_gel_for_electrophoresis_-_CPHST_-_USDA_photo.jpg|miniaturadaimagem|271x271px|Carregamento de amostras de DNA nos poços de um gel de agarose usando uma pipeta multicanal