A reconstrução de circuitos neurais é a reconstrução do circuito detalhado do sistema nervoso (ou de uma parte do sistema nervoso) de um animal. Às vezes é chamada de reconstrução EM, já que o principal método utilizado é o microscópio eletrônico (ME). Esse é um tema diretamente relacionado à engenharia reversa de dispositivos desenvolvidos pelo homem e integra o campo da conectômica, que por sua vez é um subcampo da neuroanatomia .

Sistemas modelo Os sistemas modelo que são mais utilizados para a reconstrução de circuitos são o nematóide C. elegans, a mosca-da-fruta, o rato, e o ser humano. O C. elegans e a mosca-da-fruta têm a vantagem de seus sistemas nervosos serem pequenos o suficiente para serem reconstruídos em sua totalidade, além de os organismos serem bem estudados em outros domínios, como genética e comportamento. O rato e o ser humano são vertebrados e mamíferos, com sistemas nervosos maiores e mais capazes, mas seus cérebros são muito grandes para serem reconstruídos completamente.

Mais recentemente foram incluidos nas pesquisas organismos modelo como peixe-zebra em estágio larval e o Danionella cerebrum . Esses organismos têm a vantagem de serem opticamente transparentes, o que permite que registros da atividade neural (tipicamente imagens de cálcio ) sejam realizados no mesmo animal que será posteriormente reconstruído. Isso permite que os pesquisadores contornem algunsproblemas de variabilidade entre animais causados pela tentativa de correlacionar o comportamento observado em um animal com o circuito reconstruído de um animal diferente.

Preparação da amostra Para microscopia eletrônica, a amostra deve ser fixada, corada e incluída em plástico. Técnicas experimentais de expansão óptica, como LICONN precisam ser envolvidas em gel transparente e utilizam anticorpos para marcação.

Imagens Para coleta de imagens por microscopia eletrônica, a amostra pode ser dividida em fatias finas com um micrótomo e, e na seguência, analisada por microscopia eletrônica de transmissão . Esse método é comumente chamado de ssTEM, abreviação de Microscopia Eletrônica de Transmissão por Seções Seriais.

Outra possibilidade inclui, a amostra ser imageada com um microscópio eletrônico de varredura, a superfície abrasada usando um feixe de íons focalizado, conhecido como FIB-SEM , ou recortada usando um micrótomo no microscópio. Em seguida, a amostra é imageada novamente, e o processo é repetido até que o volume desejado seja processado.

Caso seja utilizada a técnica LICONN descrita acima, a amostra é imageada utilizando um microscópio confocal ou por meio de microscopia de fluorescência de folha de luz .

Processamento de imagens O primeiro passo é alinhar as imagens individuais em um volume tridimensional coerente.

O volume é então anotado usando um dos dois métodos principais. O primeiro identifica manualmente os esqueletos de cada neurito . A segunda técnica utiliza software de visão computacional para identificar voxels pertencentes ao mesmo neurônio. As técnicas mais conhecidas são arquiteturas U-Net para prever afinidades voxel a voxel combinadas com uma segmentação por bacias hidrográficas e redes de preenchimento por inundação. Essas abordagens produzem uma supersegmentação que pode ser aglomerada manual ou automaticamente para representar corretamente um neurônio. Mesmo para segmentações aglomeradas de forma automatica, muito trabalho de revisão manual são necessário para obter a maior precisão. Em seguida, as sinapses dentro do volume são detectadas usando técnicas de aprendizado de máquina. Análises adicionais, também usando aprendizado de máquina, são frequentemente empregadas para prever o tipo de neurotransmissor de cada sinapse.

Exemplos notáveis

O conectoma de C. elegans foi o trabalho seminal nesta área. Este circuito foi obtido com grande esforço usando seções cortadas manualmente e anotação puramente manual em filme fotográfico. Por muitos anos, esta foi a única reconstrução de circuito disponível. O sistema nervoso central (tanto o cérebro como o cordão nervoso ventral associado) da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster foi reconstruído para moscas machos e fêmeas . Estas publicações de dados incluem ferramentas online para consultar o conectoma. O Córtex Humano H01, lançado em 2021, é um volume de 1,4 petabytes de uma pequena amostra de tecido cerebral humano imagiado em resolução nanométrica por microscopia eletrônica de seção seriada, reconstruído e anotado por técnicas computacionais automatizadas e analisado para insights preliminares sobre a estrutura do córtex humano. Em seu estudo de 2022 "Comparação conectômica do córtex de camundongos e humanos", os pesquisadores reconstruíram 9 conectomas entre espécies: conjuntos de dados de camundongo, macaco e humano .

Consultando o conectoma A obtenção de conectomas do cérebro de organismos superiores requer uma quantidade considerável de dados. Para uma reconstrução recente do cordão nervoso ventral da mosca-das-frutas, por exemplo, aproximadamente 86 terabytes de dados de imagem foram processados, por humanos e computadores, para gerar vários gigabytes de dados de conectoma. A interação facilitada com esses dados requer uma interface de consulta interativa, na qual os pesquisadores possam examinar a porção de dados de seu interesse sem precisar baixar todo o conjunto de dados e sem treinamento específico. Um exemplo específico dessa tecnologia é a interface NeuPrint para os conectomas gerados no HHMI. Isso simula a infraestrutura da genética, onde ferramentas de consulta interativa, como o BLAST, são normalmente usadas para examinar genes de interesse, que, na maioria das pesquisas, compreendem apenas uma pequena porção do genoma.

Limitações e trabalhos futuros A compreensão do funcionamento detalhado das redes reconstruídas também requer conhecimento das junções comunicantes (difíceis de visualizar com as técnicas existentes), da identidade dos neurotransmissores e da localização e identidade dos receptores . Além disso, os neuromoduladores podem se difundir por grandes distâncias e ainda afetar fortemente a função. Atualmente, essas características devem ser obtidas por meio de outras técnicas.

A microscopia de expansão pode fornecer uma alternativa à microscopia eletrônica (ME) para a reconstrução de circuitos. Em 2024, uma nova técnica chamada LICONN combinou a expansão de hidrogel com microscopia óptica (em oposição à microscopia eletrônica) para gerar conectomas em nível neuronal. As vantagens potenciais incluem equipamentos mais baratos, aquisição de dados mais rápida e marcação multicolorida. O equipamento é mais barato, pois um microscópio confocal é menos dispendioso do que um microscópio eletrônico. A aquisição de dados é mais rápida, uma vez que apenas uma mudança de foco, e não o seccionamento físico, é necessária. A marcação multicolorida é útil, pois algumas características, como junções comunicantes, são difíceis de detectar em microscopia eletrônica, mas são facilmente marcadas por anticorpos em imagens ópticas. Usando conjugados anticorpo-oligonucleotídeo e corantes correspondentes, dezenas a centenas de marcações são provavelmente viáveis. Estas podem auxiliar na identificação de neurotransmissores e na identificação de outras estruturas que são difíceis de interpretar em imagens de ME monocromáticas.

Referências

Categoria:Códigos neurais Categoria:Redes neurais Categoria:Neurociência