miniatura|O complexo promotor da anafase (APC) é un gran complexo proteico que contén de 11 a 13 subunidades, incluíndo unha subunidade RING (Apc11) e unha culina (Apc2). A actividade do APC require a asociación con subunidades activadoras (Cdc20 ou Cdh1) que contribúen á unión co substato.
O complexo promotor da anafase ou ciclosoma, tamén chamado, polas súas siglas en inglés, APC ou APC/C (Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome), é unha ubiquitina ligase E3 que marca proteínas diana do ciclo celular para a súa degradación no proteosoma de 26S. O APC/C é un complexo grande de 11 a 13 proteínas subunidade, entre as cales están unha culina (Apc2) e a subunidade RING (Apc11) similar ao SCF. Outras partes do APC/C teñen funcións descoñecidas mais están altamente conservadas.
O descubrimento do APC/C (e do SCF) e o seu papel clave na regulación do ciclo celular eucariota estableceu a importancia da proteólise mediada pola ubiquitina na bioloxía celular. A ubiquitinación e a subseguinte degradación de proteínas polo proteosoma, unha vez que foi percibida como un sistema exclusivamente implicado en eliminar proteínas danadas da célula, é agora considerado un mecanismo regulador universal para a transdución de sinais, cuxa importancia se aproxima á da fosforilación de proteínas.
En 2014, mapouse o APC/C en 3D a unha resolución de menos dun nanómetro, o cal tamén serviu para descubrir a súa estrutura secundaria. Este descubrimento podería mellorar a nosa comprensión do cancro e revelar novos sitios de unión para futuros fármacos contra o cancro.
Función miniatura|A actividade de M–Cdk promove os eventos da mitose temperá, que resultan no aliñamento metafásico das cromátides irmás no fuso. A actividade de M–Cdk tamén promove a activación de APCCdc20, o cal desencadea a anafase e a saída da mitose ao estimular a destrución de proteínas reguladoras, como a securina e as ciclinas, que gobernan estes eventos. Ao promover a destrución de ciclinas e así a inactivación de Cdk, a APCCdc20 tamén desencadea a activación de APCCdh1, asegurando deste xeito a actividade continuada do APC na fase G1.
A principal función do APC/C é desencadear a transición desde a metafase á anafase ao etiquetar proteínas específicas para a súa degradación. As tres maiores dianas para a degradación do APC/C son a securina e as ciclinas S e M. A securina libera a separase, unha protease, cando se degrada. Despois, a separase desencadea o corte ou clivaxe da cohesina, o complexo proteico que une as cromátides irmás. Durante a metafase, as cromátides irmás están ligadas entre si por complexos de cohesina intactos. Cando a securina sofre ubiquitinación pola APC/C e libera a separase, a cal degrada a cohesina, as cromátides irmás quedan libres para moverse a polos opostos do fuso na anafase. O APC/C tamén ten como diana as ciclinas mitóticas para a súa degradación, o que ten como resultado a inactivación dos complexos M-CDK (quinase dependente de ciclina mitótica), promovendo a saída da mitose e a citocinese.
A diferenza do SCF, unha serie de subunidades activadoras controlan o APC/C. Cdc20 e Cdh1 son dous activadores de especial importancia para o ciclo celular. Estas proteínas desencadean o APC/C contra conxuntos específicos de substratos en diferentes momentos do ciclo celular, o que fai que o ciclo avance. O APC/C tamén exerce un papel integral no mantemento do metabolismo da cromatina, especialmente nas fases G1 e G0, e xoga un papel clave na fosforilación da histona H3 por medio da destrución da aurora A quinase.
Os substratos críticos do APC/C parecen ser a securina e as ciclinas de tipo B. Isto está conservado entre os mamíferos e os lévedos. De feito, un lévedo é viable en ausencia do APC/C se se elimina a necesidade de atacar eses substratos.
Subunidades
Non hai unha gran cantidade de investigacións sobre as subunidades do APC/C, que funcionan principalmente como adaptadores. Os estudos das subunidades do APC realízanse principalmente en lévedos, e ditos estudos mostran que a maioría das subunidades do APC de lévedos están tamén presentes en vertebrados; isto suxire a conservación das subunidades nos eucariotas. En vertebrados atopáronse once subunidades centrais do APC e trece en lévedos. As subunidades activadoras únense ao APC en varios estadios do ciclo celular para controlaren a súa actividade de ubiquitinación, a miúdo ao dirixiren o APC contra os substratos diana destinados á ubiquitinación. Propúxose que a especificidade das APC ligases está controlada pola incorporación de factores de especificidade no complexo da ligase, en vez de pola fosforilación de substrato. A subunidade CDC20 permite que o APC degrade substratos como os inhibidores da anafase (Pdsp1) ao principio da anafase; por outra parte cando o CDC20 está substituído polo factor de especificidade Hct1, o APC degrada un conxunto diferente de substratos, particularmente as ciclinas da mitose na anafase tardía. Os activadores CDC20 e Cdh1 son de especial importancia e son as subuniddes máis amplamente estudadas e habituais do APC/C.
O centro catalítico do APC/C consiste na subunidade culina Apc2 e a subunidade de dominio RING H2 Apc11. Estas dúas subunidades catalizan a ubiquitinación de substratos cando o dominio C-terminal da Apc2 forma un complexo fortemente unido coa Apc11. O RING/APc11 únese ao conxugado E2-ubiquitina que cataliza a transferencia da ubiquitina a un sitio activo de E2. Ademais da funcionalidade catalítica, outras proteínas do corazón do complexo APC están compostas por múltiples motivos repetidos co propósito principal de proporcionar un soporte de armazón molecular. Estas inclúen a Apc1, a subunidade máis grande que contén 11 repeticións en tándem de secuencias de 35-40 aminoácidos, e a Apc2, que contén tres repeticións de culina de aproximadamente 130 aminoácidos en total. Os principais motivos nas subunidades do APC inclúen motivos tetratricopéptido (TPR) e repeticións WD40. As rexións C-terminal de CDC20 e Cdh1 teñen un dominio WD40 que se suxire forma unha plataforma de unión que se une a substratos do APC, contribuíndo así á capacidade do APC de atacar estes substratos, aínda que se descoñece o mecanismo exacto polo cal se produce este incremento da actividade do APC. Tamén suxeriu que as variacións nestes dominios WD40 resultan en variacións na especificidade de substrato, o cal se confirmou en estudos recentes que indican que diferentes substratos do APC poden unirse de forma directa e específica a Cdc20 e Cdh1/Hct1. Finalmente, as diferenzas de especificidade son responsables da orde e momento de destrución de varias dianas do APC durante da mitose, de modo que CDC20 ataca uns poucos substratos principais na metafase e Cdh1 ataca un conxunto máis amplo de substratos na mitose tardía e fase G1.
As 4 subunidades do APC/C de lévedos constan enteiramente de repeticións múltiples do motivo tetratricopéptido (TPR) de 34 residuos de aminoácidos. Estas subunidades TPR, Cdc16, Cdc27, Cdc23 e Apc5, proporcionan principalmente un armazón e soporte ás interaccións proteína-proteína mediadas por outros. O Cdc27 e o Cdc23 apoian a unión de Cdc20 e Cdh1, xa que as mutacións en residuos clave destas subunidades causan un incremento da disociación dos activadores. O Apc10/Doc1 promove a unión ao substrato ao mediar nas súas interaccións con Cdh1 e Cdc20.
En concreto, CDC20 (tamén chamdo p55CDC, Fizzy ou Slp1) inactiva CDK1 por ubiquitinación de ciclinas de tipo B. Isto ten como resultado a activación de Cdh1 (tamén chamado relacionado con Fizzy, Hct1, Ste9 ou Srw1), que interacciona co APC durante a mitose tardía e a G1/G0. A Cdh1 é inactivada por fosforilación durante as fases S, G2 e a fase M temperá. Durante estes momentos do ciclo, non se pode ensamblar.
APC3 e APC7 serven para recrutar Cdh1 no complexo promotor da anafase. Isto apoia tamén que a Cdh1 é a responsable de manter a actividade do APC durante G1. A Cdh1 non necesita o APC para ser fosforilada e poder unirse, de feito, a fosforilación de Cdh1 por Cdks impídelle unirse ao APC desde a fase S á M. Coa destrución de M-Cdk, poden producirse agora a liberación de CDC20 do APC e a unión de Cdh1, permitindo que a actividade do APC continúe durante a entrada a G1. Mentres que a Cdh1 recoñece as ciclinas M e S, permitindo a súa destrución ata que toda a célula queda determinada para avanzar a un novo ciclo, non recoñece as ciclinas G1/S, e durante a fase G1/S, a actividade das ciclina pode aumentar sen obstáculo e fosforilan, e dese modo inactivan, a Cdh1 e, polo tanto, o APC.
A subunidade Apc15 xoga un papel importante na activación do APC/CCdc20 despois da biorientación de cromátides irmás na placa metafásica. Cando os cinetocoros non están unidos ao fuso, os complexos do punto de control da mitose (MCC) inhiben o APC. En ausencia de Apc15, MCCs e Cdc20 permanecen bloqueados no APC/C impedindo a súa acividade unha vez que se cumpren os requirimentos do punto de control do fuso. A Apc15 media no recambio de Cdc20 e MCCs para proporcionar información sobre o estado de unión dos cinetocoros.
CDC27/APC3 Unha das subunidades que presenta o motivo TPR, a CDC27, comprobouse que interacciona con proteínas do punto de control da mitose, como Mad2, p55CDC e BUBR1, o que indica que pode estar implicada na sincronización de eventos na fase M."Entrez Gene: CDC27 cell division cycle 27 homolog (S. cerevisiae)". Hai probas que sinalan que a CDC27 forma parte dun complexo ternario con SMAD2/3 e Cdh1, que se crea en resposta á sinalización de TGFβ. Debido á súa interacción con Cdh1 en particular, ten un posible papel na determinación da afinidade entre o APC e os seus activadores Cdc20 e Cdh1. Un estudo suxire que a fosforilación de Cdc27 inducida polo TGF-β mellora a interacción entre Cdc27 e Cdh1, que está directamente implicada na activación do APC. A CDC27 pode funcionar como un vehículo a través do cal a sinalización de TGFβ pode activar o APC. A hiperfosforilación de CDC27 inducida por TGFβ xera unha elevada actividade do APC.
CDC23, CDC16, CDC27 A CDC23, outra subunidade con TPR interacciona con SWM1, uníndose á caixa D de CLB2. Baseándose en ensaios de híbridos in vivo e coinmunoprecipitación in vitro, suxeriuse que Cdc16p, Cdc23p e Cdc27p (análogos en Saccharomyces cerevisiae) interaccionan e forman un complexo macromolecular. Sinalouse que o seu tema común de TPR media nestas interaccións. En canto Cdc27 e Cdc16 en Drosophila, testáronse as súas funcións por interferencia de ARN (RNAi). Os resultados suxiren que poden mediar na actividade do complexo enteiro por mecanismos diferentes en sitios distintos. Noutros estudos nas moscas drosófilas, Cdk16 e Cdk23 parecen activarse por fosforilación realizada pola quinase similar a Polo 1 (Plk1), e a molécula correspondente de lévedos de fisión parece unirse especialmente a Cdc23.
O complexo está regulado polos activadores CDC20 e Cdh1 durante a mitose. O seu papel na degradación da ciclina B está demostrado por un cribado de mutantes de Saccharomyces cerevisiae defectivos para a degradación de ciclina B, que teñen mutacións nos xenes CDC16 e CDC23. Nos mutantes para CDC27, CDC23 e CDC 27 prodúcese en todos os casos a detención do ciclo celular na metafase.
Recoñecemento de substrato