miniatura|Un moderno aparato compacto autónomo de HPLC. miniatura|300px|Representación esquemática dunha unidade de HPLC. (1) Depósitos de solvente, (2) Desgasificador de solvente, (3) Válvula de gradiente, (4) Vaso de mestura para a introdución da fase móbil, (5) Bomba de alta presión, (6) Válvula interruptora en "posición de inxección", (6') Válvula interruptora en "posición de carga", (7) Bucle de inxección da mostra, (8) Precolumna (columna de garda), (9) Columna analítica, (10) Detector (de raios infravermellos, de UV), (11) Adquisición de datos, (12) Colector de fraccións ou residuos.
A cromatografía líquida de alto rendemento, xeralmente abreviada HPLC (do inglés High-performance liquid chromatography), anteriormente denominada cromatografía líquida de alta presión, é unha técnica de laboratorio de química analítica usada para separar, identificar e cuantificar cada compoñente nunha mestura. A técnica recibe tamén outros diversos nomes na literatura internacional, como cromatografía líquida/de líquidos/en fase líquida de alta eficacia/eficiencia/resolución. A técnica baséase no uso de bombas para facer pasar un solvente líquido presurizado que contén a mestura da mostra a través dunha columna, que está chea dun material adsorbente sólido. Cada compoñente da mostra interacciona de xeito lixeiramente diferente co material adsorbente, causando diferentes velocidades de fluxo para diferentes compoñentes e orixinando a separación dos compoñentes a medida que estes flúen saíndo da columna.
A HPLC foi utilizada para fabricar produtos (por exemplo, durante o proceso de produción de produtos farmacéuticos ou biolóxicos), ten usos legais (por exemplo, para detectar drogas dopantes que aumentan o rendemento ou de abuso en urina), en investigación (por exemplo, separar os compostos dunha mostra biolóxica complexa, ou separar substancias químicas similares unhas das outras), e usos médicos (por exemplo, a detección dos niveis de vitamina D no soro sanguíneo).
Unha cromatografía pode describirse como un proceso de transferencia en masa que implica a adsorción. A HPLC require o uso de bombas para facer pasar un líquido presurizado e a mestura da mostra a través dunha columna chea co adsorbente, o que causa a separación dos compoñentes da mostra. O compoñente activo da columna, o adsorbente, é normalmente un material granular feito de partículas sólidas (por exemplo, sílice, polímeros etc.), dun tamaño de 2 a 50 μm. Os compoñentes da mestura da mostra sepáranse uns dos outros debido aos seus diferentes graos de interacción coas partículas do adsorbente. O líquido presurizado adoita ser unha mestura de solventes (por exemplo, auga, acetonitrilo e/ou metanol) e denomínase "fase móbil". A súa composición e temperatura xogan un papel principal no proceso de separación ao influíren nas interaccións que teñen lugar entre os compoñentes da mostra e o adsorbente. Estas interaccións son de natureza física, como as hidrófobas (dispersivas), dipolo–dipolo e iónicas, ou, máis frecuentemente, unha combinación delas.
A HPLC distínguese da tradicional cromatografía líquida ("de baixa presión") porque as presións ás que opera son significativamente maiores (50–350 bar), mentres que a cromatografía líquida ordinaria normalmente depende da forza da gravidade para que a fase móbil pase a través da columna. Debido á pequena cantidade de mostra separada nunha HPLC analítica, as dimensións dunha columna típica son de 2,1–4,6 mm de diámetro e 30–250 mm de longo. Ademais as columnas de HPLC están feitas con partículas adsorbentes máis pequenas (de 2–50 μm como media de tamaño da partícula). Isto dálle á HPLC un poder de resolución superior (a capacidade de distinguir entre compostos) á hora de separar os compoñentes de mesturas, o que fixo que se convertese nunha técnica cromatográfica moi utilizada.
O esquema dun aparello de HPLC consta normalmente dun desgasificador, mostreador, bombas e un detector. O mostreador leva a mestura da mostra ao fluxo de fase móbil que a transporta pola columna. A bomba introduce o fluxo desexado e a composición da fase móbil na columna. O detector xera un sinal proporcional á cantidade de compoñentes da mostra que saen da columna, polo que permite unha análise cuantitativa dos compoñentes da mostra. Un microprocesador dixital e software de usuario controlan o aparello de HPLC e proporcionan datos da análise. Algúns modelos de bombas mecánicas no instrumento de HPLC poden mesturar múltiples solventes en proporcións que poden cambiar co tempo, xerando un gradiente de composición na fase móbil. Úsanse comunmente varios detectores, como os UV/Vis (ultravioleta/visible), os de matriz de fotodíodos (PDA) ou os baseados en espectrometría de masas. A maioría dos aparellos de HPLC tamén teñen un forno da columna que permite axustar a temperatura á que se produce a separación.
Funcionamento
A mestura da mostra que vai ser separada e analizada introdúcese nun volume pequeno discreto (normalmente microlitros) na corrente de líquido da fase móbil que percola a través da columna. Os compoñentes da mostra móvense pola columna a diferentes velocidades, que están en función das interaccións físicas específicas co adsorbente (tamén chamado fase estacionaria). A velocidade de cada compoñente depende da súa natureza química, da natureza da fase estacionaria (columna) e da composición da fase móbil. O tempo ao cal un analito determinado elúe (sae da columna) denomínase tempo de retención. O tempo de retención medido en condicións determinadas é unha característica identificadora dun analito dado.
Existen moitos tipos de columnas, cheas de adsorbentes que varían no tamaño da partícula e na natureza da súa superficie ("química de superficie"). O uso de materiais de empaquetado de tamaño de partícula máis pequeno require o uso dunha maior presión operacional ("presión traseira" ou "backpressure") e normalmente mellora a resolución cromatográfica (o grao da separación de picos entre analitos consecutivos que saen da columna). As partículas adsorbentes poden ser hidrófobas ou polares.
As fases móbiles comúns utilizadas son calquera combinación miscible de auga con varios solventes orgánicos (os máis comúns son acetonitrilo e metanol). Algunhas técnicas de HPLC usan fases móbiles sen auga (ver cromatografía en fase normal máis abaixo). O compoñente acuoso da fase móbil pode conter ácidos (como o fórmico, fosfórico ou trifluoroacético) ou sales para axudar na separación dos compoñentes da mostra. A composición da fase móbil pode manterse constante ("modo de elución isocrático") ou variar ("modo de elución de gradiente") durante a análise cromatográfica. A elución isocrática é xeralmente efectiva para a separación de compoñentes da mostra que son moi diferentes nas súas afinidades pola fase estacionaria. Na elución de gradiente a composición da fase móbil varíase normalmente desde unha baixa a unha alta forza de elución. A forza de elución da fase móbil reflíctese polos tempos de retención do analito, xa que con alta forza de elución prodúcese unha rápida elución (=tempos de retención curtos). Un perfil de gradiente típico en cromatografía en fase inversa pode empezar cun 5% de acetonitrilo (en auga ou tampón acuoso) e progresa linearmente a un 95% de acetonitrilo en 5–25 minutos. Poden formar parte do perfil períodos con composición constante da fase móbil. Por exemplo, a composición da fase móbil pode manterse constante a un 5% de acetonitrilo durante 1–3 min, seguido dun cambio linear ata un 95% de acetonitrilo. miniatura|Un colector de fracción rotatoria recollendo a saída dunha HPLC. O sistema está usándose para illar unha fracción que contén o Complexo I das membranas plasmáticas de Escherichia coli. Necesitáronse aproximadamente 50 litros de bacteria para illar esta cantidade. A composición elixida da fase móbil (tamén chamada eluente) depende da intensidade das interaccións entre os diversos compoñentes da mostra ("analitos") e da fase estacionaria (por exemplo, interaccións hidrófobas na HPLC en fase inversa). Dependendo da súa afinidade polas fases estacionarias e móbil así se producirá a partición dos analitos entre as dúas durante o proceso de separación que ten lugar na columna. Este proceso de partición é similar ao que ocorre durante unha extracción líquido-líquido pero é continua, non por etapas. Neste exemplo, usando un gradiente de auga/acetonitrilo, eluirán ao final os compoñentes hidrófobos (sairán da columna), unha vez que a fase móbil se fai máis concentrada en acetonitrilo, é dicir, nunha fase móbil de maior forza de elución.
A elección dos compoñentes da fase móbil, os aditivos (como sales ou ácidos) e as condicións do gradiente dependen da natureza dos compoñentes da mostra e da columna. Adoitan facerse unha serie de cromatografías de ensaio coa mostra para atopar o método de HPLC que rende unha separación axeitada.
Historia e desenvolvemento
Antes da aparición da HPLC os científicos utilizaban as técnicas estándar de cromatografía líquida. Os sistemas de cromatografía líquida eran bastante pouco eficientes debido a que a velocidade do fluxo dos solventes dependía da gravidade. As separacións tardaban moitas horas, e ás veces días completos. Naquela época a cromatografía de gases (GC) era máis poderosa que a cromatografía líquida (LC), pero críase que a separación en fase gasosa e a análise de biopolímeros de elevado peso molecular moi polares era imposible. A cromatografía de gases non era efectiva debido á inestabilidade térmica dos solutos.Henry, Richard A. (1 February 2009) "The Early Days of HPLC at Dupont" . Chromatography Online. Avanstar Communications Inc. Como resultado, hipotetizáronse métodos alternativos que acabarían desembocando no desenvolvemento da HPLC.
Despois dos traballos pioneiros de Martin e Synge en 1941, os científicos Cal Giddings, Josef Huber e outros predixeron na década de 1960 que a cromatografía líquida podía funcionar nun modo de alta eficiencia reducindo o diámetro das partículas substancialmente por debaixo do nivel de 150 μm usado na cromatografía líquida típica (e na cromatografía de gases) e usando presión para incrementar a velocidade da fase móbil. Estas predicións foron amplamente experimentadas e refinadas durante as décadas de 1960 e 1970. As primeiras investigacións para o seu desenvolvemento empezaron a mellorar as partículas de cromatografía líquida, e a invención de Zipax, unha partícula de superficie porosa, era moi prometedora para a tecnoloxía da HPLC.Iler, R.K. (1979) The Chemistry of Silica. John Wiley & Sons. New York.
Na década de 1970 houbo moitos desenvolvementos en hardware e instrumentos. Empezaron a usarse bombas e inxectores para facer un deseño rudimentario dun sistema de HPLC. As bombas amplificadoras de gases foron ideais porque funcionan a presión constante e non requiren selos impermeables ou válvulas de comprobación para que haxa un fluxo estable e unha boa cuantificación. Fixéronse avances importantes en hardware en Dupont IPD (Industrial Polymers Division), como o dispositivo de gradiente de volume de pausa baixa (low-dwell-volume gradient) utilizado patra substituír o inxector de septo por unha válvula de bucle de inxección.