miniatura|360px|dereita|Maquinaria molecular que impulsa a fusión de vesículas na liberación de neuromediadores. O complexo SNARE central está formado por catro hélices α pertencentes á sinaptobrevina, á sintaxina e á SNAP-25 (dúas hélices), mentres que a sinaptotagmina funciona como un sensor do calcio e regula a unión en cremalleira do SNARE.
Os SNARE son unha gran superfamilia de proteínas que consta de máis de 60 membros, atopados en lévedos e mamíferos. Denomínanse co acrónimo procedente da lingua inglesa SNARE, que deriva de SNAP REceptor (Receptor de SNAPs), e á súa vez SNAP deriva de Soluble NSF Attachment Protein (Proteína de unión a NSF soluble), e, finalmente, NSF significa N-ethylmaleimide Sensitive Factor ou NS fusion protein (Factor sensible á N-etilmaleimida, ou proteína de fusión sensible á N-etilmaleimida). O principal papel das proteínas SNARE é mediar na fusión de vesículas, é dicir, a fusión de vesículas cos seus compartimentos diana celulares rodeados de membrana aos que van destinadas (como os lisosomas). Os SNAREs mellor estudados son os que median o atraque de vesículas sinápticas na membrana presináptica das neuronas. Estes SNAREs son as dianas de neurotoxinas bacterianas responsables do botulismo e tétano.
Tipos
Os SNAREs poden dividirse en dúas categorías: "de vesícula" (v-SNAREs), que se incorporan ás membranas das vesículas de transporte durante a súa evaxinación, e "de diana"" ou target (t-SNAREs), que están localizados nas membranas dos compartimentos diana. A evidencia indica que os t-SNAREs forman subcomplexos estables que serven como guías para a unión de v-SNAREs para completar a formación do complexo SNARE. Non obstante, varias proteínas SNARE están localizadas tanto en vesículas coma nas membranas dos compartimentos diana, polo que un sistema de clasificación máis recente ten en conta as características estruturais dos SNAREs, e divídeos en R-SNAREs e Q-SNAREs. A miúdo, os R-SNAREs actúan como v-SNAREs e os Q-SNAREs fano como t-SNAREs. Os R-SNAREs son proteínas que contribúen cun residuo de arxinina (R) á formación da capa iónica cero no complexo central SNARE ensamblado. Un exemplo de R-SNARE é a sinaptobrevina, que está localizada nas vesículas sinápticas. Os Q-SNAREs son proteínas que contribúen cun residuo de glutamina (Q) á formación da capa iónica cero no complexo central SNARE ensamblado. Entre os Q-SNAREs están a sintaxina e a SNAP-25. Finalmente, os Q-SNAREs poden ser clasificados nos subtipos Qa, Qb, ou Qc dependendo da súa localización no feixe de catro hélices.
Estrutura
Os SNAREs son proteínas pequenas, abundantes e cunha cola ancorada, que a miúdo son inseridas postraducionalmente nas membranas por medio do seu dominio transmembrana C-terminal. Sete dos 38 SNAREs coñecidos, entre os que está SNAP-25, non teñen dominio transmembrana e insírense uníndose á membrana por medio de modificacións lipídicas como a palmitoilación. As proteínas con cola ancorada poden inserirse na membrana plasmática, retículo endoplasmático, mitocondria, e peroxisomas, entre outras membranas, pero un determinado SNARE é destinado a unha única membrana. A marcaxe do destino dos SNAREs realízase alterando ou ben a composición dos residuos de aminoácidos flanqueantes C-terminais ou ben a lonxitude do dominio transmembrana. A substitución do dominio transmembrana por áncoras lipídicas orixina un estado intermedio de fusión de membranas no que só se fusionan as dúas capas en contacto das bicapas das membranas e non o fan as dúas capas distais das bicapas das dúas membranas.
Aínda que os SNAREs varían considerablemente en estrutura e tamaño, todos comparten un segmento no seu dominio citosólico chamado motivo SNARE, que consta de 60 a 70 aminoácidos e contén repeticións de héptada que teñen a capacidade de formar estruturas de hélice superenrolada (coiled-coil). Os v- e t-SNAREs poden ensamblarse reversiblemente en feixes de catro hélices apertados chamados complexos "trans"-SNARE. Nas vesículas sinápticas, os complexos "trans" metaestables rapidamente formados están compostos por tres SNAREs: sintaxina 1 e SNAP-25 residentes na membrana celular e a sinaptobrevina (tamén denominada proteína de membrana asociada a vesículas ou VAMP) ancorada na membrana da vesícula.
Na exocitose neuronal, a sintaxina e a sinaptobrevina están ancoradas nas respectivas membranas polos seus dominios C-terminais, mentres que a SNAP-25 está amarrada á membrana plasmática por medio de varias cadeas palmitoíl ligadas a cisteína. O complexo central trans-SNARE é un feixe de catro hélices α, no que unha hélice α é proporcionada pola sintaxina 1, outra pola sinaptobrevina e dúas máis pola SNAP-25.
Os SNAREs residentes na membrana plasmática están presentes en microdominios ou agrupamentos, a integridade dos cales é esencial para que a célula realice a exocitose.
Fusión de membranas
miniatura|dereita|Capas do complexo central SNARE. No centro está a capa iónica hidrófila cero, flanqueada por capas de cremalleira de leucina hidrofóbica.
Durante a fusión de membranas, as proteínas v-SNARE e t-SNARE en membranas separadas combínanse para formar un complexo trans-SNARE, tamén chamado "SNAREpin". Dependendo do estado de fusión de membranas, estes complexos poden denominarse de diferentes maneiras.
Durante a fusión dos complexos trans-SNARE, as membranas fusiónanse e as proteínas SNARE implicadas na formación de complexos despois da fusión denomínanse complexo "cis"-SNARE, porque agora reside nunha soa (ou cis) membrana resultante. Despois da fusión, o complexo cis-SNARE únese a unha proteína adaptadora chamada alfaSNAP, que o desensambla. Despois, a ATPase AAA NSF hexamérica cataliza o despregamento dependente do ATP das proteínas SNARE e libéraas no citosol para a súa reciclaxe.
Pénsase que os SNAREs son os compoñentes centrais necesarios da maquinaria de fusión e poden funcionar independentemente de proteínas citosólicas adicionais. Isto foi demostrado polas chamadas "flipped" SNAREs (SNAREs "volteadas") producidas por enxeñaría, nas que os dominios SNARE están situados cara ao espazo extracelular en vez de cara ao citosol. Cando as células que conteñen v-SNAREs contactan con células que conteñen t-SNAREs, fórmanse os complexos trans-SNARE e prodúcese a fusión entre as células.
Compoñentes
O complexo SNARE central é un feixe de 4 hélices α. A sinaptobrevina e a sintaxina contribúen cada unha cunha hélice α, mentres que o SNAP-25 participa no complexo con dúas hélices α (abreviadas como Sn1 e Sn2). Os residuos de aminoácidos que interaccionan e se unen en cremalleira co complexo SNARE poden agruparse en capas. Cada capa ten 4 residuos de aminoácidos, un residuo por cada 4 hélices α. No centro do complexo está a capa iónica cero composta por un residuo de arxinina (R) e tres de glutamina (Q), e está flanqueado por cremalleiras de leucina. As capas '-1', '+1' e '+2' no centro do complexo seguen moi aproximadamente a xeometría ideal da cremalleira de leucina e a composición de aminoácidos.
A capa iónica cero está composta polo R56 da VAMP-2, o Q226 da sintaxina-1A, o Q53 da Sn1 e o Q174 da Sn2, e está completamente enterrado nas capas de cremalleira de leucina. O grupo guanidinio cargado positivamente do residuo de arxinina (R) interacciona cos grupos carboxilos de cada un dos tres residuos de glutamina (Q).
As capas flanqueantes de cremalleira de leucina actúan como selo impermeable á auga que serve para protexerse das interaccións iónicas dos solventes que o rodean. A exposición da capa iónica cero ao solvente acuoso ao romper as cremalleiras de leucina flanqueantes leva á inestabilidade do complexo SNARE e é o mecanismo suposto polo cal o α-SNAP e a NSF reciclan os complexos SNARE despois de que se complete a exocitose da vesícula sináptica.
Mecanismo da fusión de membranas Ensamblaxe miniatura|dereita|Esquema da formación do complexo trans-SNARE. Mostra como Munc18 interacciona con proteínas SNARE durante a formación de complexos. As proteínas SNARE deben ensamblarse nos complexos trans-SNARE para que poidan proporcionar a forza que é necesaria para a fusión de vesículas. Os catro dominios de hélice α (un de cada sinaptobrevina e sintaxina, e dous da SNAP-25) xúntanse para formar un motivo de hélice superenrolada. O paso limitante no proceso de ensamblaxe é a asociación do dominio SNARE da sintaxina, xa que se encontra normalmente nun estado "pechado" no que non pode interaccionar con outras proteínas SNARE. Cando a sintaxina está nun estado aberto, a formacióin do complexo trans-SNARE empeza coa asociacióin dos catro dominios SNARE no seu N-terminal. Os dominios SNARE actúan formando un motivo en hélice superenrolada na dirección do C-terminal dos seus dominios respectivos.
A proteína SM Munc18 crese que xoga un papel na ensamblaxe do complexo SNARE, aínda que o mecanismo exacto polo cal actúa é aínda debatido. Sábese que o enganche de Munc18 bloquea a sintaxina nunha conformación pechada ao unirse aos dominios α-helicoidais SNARE, que inhibe que a sintaxina entre nos complexos SNARE (e dese modo inhibe a fusión de vesículas). Porén, o enganche pode tamén unirse ao feixe completo de catro hélices do complexo trans-SNARE. Unha hipótese suxire que, durante a ensamblaxe do complexo SNARE, o enganche de Munc18 libera a sintaxina pechada, permanece asociado co péptido N-terminal da sintaxina (o que permite a asociación do dominio SNARE da sintaxina con outras proteìnas SNARE), e despois volve a unirse ao complexo SNARE de catro hélices acabado de formar. Este posible mecanismo de disociación e a subseguinte reasociación cos dominios SNARE podería ser dependente do calcio. Isto apoia a idea de que Munc18 xoga un papel clave regulador na fusión de vesículas; baixo condicións normais Munc18 impedirá que se forme o complexo SNARE, pero cando se desencadea a acción de Munc18 esta axudará á ensamblaxe do complexo SNARE e, por tanto, actúa como un catalizador da fusión.
Apertura de unión en cremalleira e poro de fusión
miniatura|dereita| Esta figura proporciona un resumo simple da interacción das proteínas SNARE con vesículas durante a exocitose. Mostra a ensamblaxe do complexo SNARE, unión en cremalleira, e desensamblaxe.
A fusión de membranas comprende unha serie de eventos moi esixentes enerxeticamente, que requiren a translocación de proteínas na membrana e a alteración da bicapa lipídica, seguida da formación dunha estrutura de membrana moi curvada. O proceso de xuntar as dúas membranas require enerxía para superar as forzas electrostáticas repulsivas entre as membranas. Non se coñece o mecanismo que regula o movemento das proteínas asociadas a membranas fóra da zona do contacto entre membranas antes de que se produza a fusión, pero o incremento local na curvatura da membrana crese que contribúe ao proceso. Os SNAREs xeran enerxía por medio de interaccións proteína-lípido e proteína-proteína, que actúan como unha forza impulsora da fusión de membranas.
Un modelo hipotetiza que a forza necesaria para xuntar as dúas membranas durante a a fusión procede do cambio conformacional nos complexos trans-SNARE para formar complexos cis-SNARE. A hipótese actual que describe este proceso denomínase "unión en cremalleira" dos SNAREs.