mini|Un lampírido del grupo Lampyris noctiluca. Gracias a una reacción bioquímica con luciferinas específicas de la especie obtiene luz. Las luciferinas son compuestos que se utilizan para la obtención de luz en organismos bioluminiscentes. Mediante la actividad catalítica de la enzima luciferasa correspondiente, reaccionan con oxígeno (oxidación). Por el cambio, la mayoría de los grupos funcionales eliminados de la luciferina liberan energía en forma de luz. Tanto las luciferinas como las luciferasas son taxón específica, es decir características de cada especie.
Historia A comienzos del René Réaumur observó que el polvo seco y molido de organismos bioluminiscentes brillaba al ponerles en contacto con agua. Las primeras investigaciones sobre el sistema de luciferina-luciferasa se le atribuyen al francés Raphaël Dubois, que en 1885 descubrió mediante su trabajo con luciérnagas y con el bivalvo Pholas dactylus en 1887, que en el fenómeno de la Bioluminiscencia existían un par de sustancias; una de ellas se consumía en presencia de la otra, la cual actuaba como catalizador y cuya consecuencia era la emisión de luz por parte de algunos organismos. Dicha sustancia que se consumía se denominó luciferina, la cual no se destruye por el calor. El otro componente lábil al calor, descrito por Dubois se denominó luciferasa. Hoy en día, la luciferasa es la enzima que convierte la luciferina en asociado reducido.
Las siguientes investigaciones fueron realizadas por el estadounidense Edmund Newton Harvey a principio del .Harvey, EN. Bioluminescence. Academic, New York 1952. Él encontró que hay una especificidad del sistema luciferina-luciferasa para diferentes especies. Así, luciferinas de una especie no pueden ser producida por otra especie. Por último, cualquier sistema bioluminiscente requiere oxígeno, lo que ya había sido observado por Robert Boyle en el .
Propiedades Al parecer los sistemas bioluminiscentes no guardan relación evolutiva entre ellos, es decir no son homólogos. Dichos procesos se presentan en unos 17 grupos de insectos diferentes y en por lo menos unas 700 especies adicionales, en su gran mayoría marinas.Hastings, JW. Bioluminescence. (N. Sperelakis, ed.)., in: Cell Physiology, Dritte Edition, Academic Press, NY., 1115–1131. Se han desarrollado una gran cantidad de estudios filogenéticos de los sistemas luciferina-luciferasa, y se han hallado más de 30 orígenes independientes.Herring PJ. (1987): Systematic distribution of bioluminescence in living organisms, in: J Biolumin Chemilumin, 1 (3); 147–163; PMID 3503524.
Definición La definición clásica habla de que el complejo luciferasa-luciferina es el que proporciona la luz. La luciferasa, mediante la utilización de oxígeno, modifica a la luciferina. En algunos casos se hace uso de cofactores como ATP o iones. La luciferina oxidada pasa a un estado de transición I y después alcanza frecuentemente una descarboxilación y muchos pasos intermedios hasta un sustrato P* activos eléctricamente. Este se descompone rápidamente (pocos nanosegundos) en su sustrato base P y emite durante este proceso fotones. Normalmente las luciferinas modificadas son también fluoróforos, ya que al irradiarlos con luz pueden pasar a un estado activado.mini|left|upright=2|La luciferina (L) se modifica mediante utilización de oxígeno por las luciferasas, ahí se forma un intermediario I y por último en un sustrato activo eléctricamente P*. Después de un corto tiempo de vida se emiten fotones y el sustrato base P se alcanza.
Principios Para pasar al sustrato activado P*, se requiere bioquímicamente de mucha energía. La emisión de fotones con una longitud de onda de 500nm (verde, energía de aproximadamente 2 eV/fotón) se utiliza 250 kJ/mol- en comparación: la hidrólisis de ATP a ADP +P libera 30kJ/mol. Además sólo se puede liberar energía en un paso.
El principio más recurrente es la creación de un tetra anillo de dioxetano, como por ejemplo dioxetano (α-peroxilactona). Después de una exitosa descarboxilación se genera el sustrato activado.
mini|upright=2|none|Un dioxetano es inestable y se descompone por separación de CO2. Esto da origen a una cetona en estado activado. En algunos casos la fluorescencia no actúa como se espera, por ejemplo en estudios en vitro (en tubos de ensayo). Para ello existen muchas causas. Así se emiten en el complejo enzima-luciferina durante la oxidación diferencias que las luciferinas libres al estímulo de la luz. A veces la energía se traslada a un segundo fluoróforo, como sucede por ejemplo con la aequorina a GFP en Aequorea victoria.
Eficiencia cuántica Q Si la transformación de una luciferina por su luciferasa correspondiente es eficiente, se determina la eficiencia cuántica Q. Se le define como el número de fotones emitidos por molécula transformada de luciferina.E. H. White et al.: The chemi- and bioluminescence of firefly luciferin: an efficient chemical production of electronically excited states. In: Bioorg. Chem. Bd. 1, Nr. 1–2, 1971, S. 92–122, . Debido a la definición, el punto máximo es Q=1, esto quiere decir, que por cada molécula transformada de luciferina un fotón de luz se libera. La mayor eficiencia cuántica que se ha comprobado es la de la luciérnaga Photinus pyralis con Q=0.41.
Tipos de Luciferina Existen muchos tipos de sistemas luciferina-luciferasa. Hay cuatro clases principales de estos, en los cuales la transformación de la luciferina por la luciferas pasa a un estado activado electrónicamente y así se vuelve un proporcionador de luz.
La luciferina de las luciérnagas, un benzotiazol mini|Un gusano que brilla de la especie Lampyris noctiluca mini|left|Photinus pyralis en vuelo Los insectos bioluminiscentes se encuentran presentes en los cuatro órdenes Collembola, Hemiptera, Coleoptera y Diptera. Aunque sólo se investigan de los dos últimos para sistemas de bioluminiscencia. En coleoptera (escarabajos) se encuentran representantes que emiten luz de las familias: phengodidae, elateridae (elatéridos) así como Lampyridae (lampíridos).
La luciérnaga Photinus pyralis pertenece a la familia de lampyridae. Fue utilizada en los estudios de Dubois sobre el complejo Luciferina-Luciferasa (comparar arriba). Los primeros estudios científicos de reacciones de bioluminiscencia se realizaron en 1917 por Harvey. Aparte este sistema de luciferina-luciferasa es el más estudiado.
Reacción de bioluminiscencia mini|left|Fórmula estructural de la D-Luciferina de la luciérnaga Photinus pyralis. Se le acorta como LH2 En la reacción, gracias a la luciferasa se transforma el sustrato D-Luciferina (LH2), un benzotiazol, bajo consumo de oxígeno. Los trabajos de William D. McErloy a finales de los años 1940 enseñaron, que para la reacción se utilizaban como cofactores ATP e iones de magnesio:Osamu Shimomura, S. 1ff.
En comparación a las luciferinas de otros sistemas, la lucferina de las luciérnagas es una unión relativamente estable. El punto de fusión es de 205-210 °C. Su coeficiente de extinción molar (absortividad) a una longitud de onda de 328nm es de ε = 18.200 M−1·cm−1. La luciferina fluoresce y tiene un máximo de emisión en λmax = 537 nm.
La luciferasa () de la luciérnaga tiene un peso molecular de ca. 60-62 kDa, en la P.pyralis exacto en 61kDa, y está conformada por 550 aminoácidos. Cataliza la descarboxilación oxidativa de la luciferina a oxiluciferina (oxi-L, ver en esquema). La reacción corre en los peroxisomas de las células del órgano lumínico.Keller, GA. et al. (1987): Firefly luciferase is targeted to peroxisomes in mammalian cells, in: Proc Natl Acad Sci USA, 84 (10): 3264–3268; PMID 3554235; . La estructura de la luciferasa de P. pyralis se presentó por primera vez en 1956 con una resolución de 200 pm. Para el análisis se necesitaron grandes cantidades de luciérnagas que obtuvieron gracias a niños, que por cada ejemplar se les pagaba un centavo.
Sin sustrato unido, las luciferasas están en una conformación abierta; una región con un aminoácido grande N-terminal y uno pequeño C-terminal forman un profundo surco. Con unión a sustrato se produce un cambio conformacional para cerrar el surco.Fraga, H. (2008): Firefly luminescence: a historical perspective and recent developments. In: Photochem Photobiol Sci. 7(2); 146–158; PMID 18264582; . A mediados de 1980 se pudo de manera exitosa introducir la luciferasa en el genoma de la bacteria E. coli y expresarse. Las luciferasas de la familia lampyridae están conformadas de manera similar entre sí. Las diferencias determinan el color de la luz emitida. De acuerdo a la especie el máximo de emisión λmax de la luz liberada está entre 530 nm (verde) y 635 nm (roja).
La reacción corre en vitro de manera óptima en un pH de 7.8 y a una temperatura entre 23-25 °C. In vivo, el color de la luz emitida es amarillo-verde hasta amarillo (552-582 nm). En el laboratorio la reacción puede tener un rango muy amplio de coloración. En medio ácido la luz toma un color rojo (615 nm), en medio neutro amarillo-verde.
Mecanismo de reacción mini|upright=2|left|Mecanismo de reacción de la luciferina El mecanismo de reacción específico es conocido. Mediante ATP ocurre una adenilicación del grupo carboxilo de la D-Luciferina, donde el pirofosfato se libera (1, en el esquema). Gracias a esta activación se puede extraer el electrón del carbono C4, y se forma un carbanión (2). Por ello se puede oxigenar la luciferina en el carbono C4 y se forma un peróxido orgánico lineal(3). Este forma bajo ruptura de AMP un anillo de dioxetano (4). Por descarboxilación se forma la oxiluciferina, que se puede presentar como monoanión (forma cetónica), 5) o como dianión (forma de enol). En ambos casos la oxiluciferina se encuentra en un estado activado. Se descompone liberando fotones (luz roja o luz amarilla-verde) volviendo a su estado basal. La oxiluciferina no se ha aislado de forma pura debido a su extrema inestabilidad.
El mecanismo de reacción con la formación de dioxietano fue estipulado a finales de 1970 gracias a los trabajos de Shimomura.Shimomura, O. et al. (1977): Source of oxygen in the CO2 produced in the bioluminescent oxidation of firefly luciferin. In: Proc Natl Acad Sci USA, 74(7); 2799–2802; PMID 16592418; . Utilizó isótopos marcados de 18O en la reacción (H218O específicamente 18O2). Los resultados de estos trabajos derribaron la hipótesis de que la oxiluciferina se formaba a partir del rompimiento de enlaces lineales.DeLuca, M. und Dempsey, ME. (1970): Mechanism of oxidation in firefly luminescence. In: Biochem Biophys Res Commun, 40(1); 117–122; PMID 5456946; .Tsuji, FI. et al. (1977): Mechanism of the enzyme-catalyzed oxidation of Cypridina and firefly luciferins studied by means of 17O2 and H218O. In: Biochem Biophys Res Commun, 74(2); 606–613; PMID 836314; . De ser así, el dióxido de carbono liberado contendría un átomo de oxígeno proveniente del agua. En realidad viene del oxígeno.
La eficacia luminosa de esta reacción es alta, ya que la eficacia cuántica Q en un pH de 8.5 está en 0.41.Ando, Y. et al. (2008): Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission, in: Nat. Photonics 2; 44–47; .
Síntesis mini|upright=2.2|Dos mecanismos propuestos para la regeneración de D-luciferina a partir de oxiluciferina, basados... Abreviaciones: LH2 Luciferina; HS-CoA Coenzima A; 2C6HB 2-Ciano-6-hidroxibenzotiazol; L oxiluciferina; Cys Cisteína; TGA ácido tioglicólico. No está muy claro la manera en la que se sintetiza la luciferina en los insectos. Se sabe que la D-luciferina no se toma de forma directa de los escarabajos (los escarabajos hembra del género Photuris, se comen a los machos del género Photinus).Eisner T. et al. (1997): Firefly»femmes fatales« acquire defensive steroids (lucibufagins) from their firefly prey, in: Proc Natl Acad Sci USA, 94 (18), 9723–9728; PMID 9275191; .
En la literatura se discuten dos caminos metabólicos para su síntesis: