miniatura|300px|derecha|Análisis de una muestra de agua marina conteniendo picoplancton fotosintético por medio de citometría de flujo mostrando tres poblaciones diferentes (Prochlorococcus, Synechococcus, y picoeucariotas)
La citometría de flujo es una tecnología biofísica basada en la utilización de luz láser, empleada en el recuento y clasificación de células según sus características morfológicas, presencia de biomarcadores, y en la ingeniería de proteínas. En los citómetros de flujo, las células suspendidas en un fluido atraviesan un finísimo tubo transparente sobre el que incide un delgado rayo de luz láser, la luz transmitida y dispersada por el pasaje de las células a través del tubo se recoge por medio de unos dispositivos de detección, permitiendo hacer inferencias en cuanto a tamaño y complejidad de las células. También permite el análisis multiparamétrico simultáneo de otras características físicas y químicas, evaluando en promedio más de dos mil partículas por segundo.
La citometría de flujo es una técnica utilizada en forma rutinaria en muchos centros de salud para el diagnóstico y seguimiento de muchas enfermedades tales como las leucemias, granulomatosis crónica, y sida; sin embargo tiene muchísimas otras aplicaciones en investigación básica, práctica y ensayos clínicos. Una variante común de esta técnica es la separación física de partículas según sus propiedades, empleándose por ejemplo para purificar poblaciones de interés.
Historia El primer citómetro de flujo basado en la medición de impedancia, es decir utilizando el principio Coulter, fue descrito en la patente de Estados Unidos N.º 2.656.508, expedida en 1953 a nombre de Wallace H. Coulter. Mack Fulwyler fue el inventor del precursor de los citómetros de flujo actuales, en particular del tipo separador de células. El primer dispositivo de citometría de flujo basado en fluorescencia (ICP 11) fue desarrollado en 1968 por Wolfgang Göhde de la Universidad de Münster, y declarado en la patente de Alemania N.º 1815352 el 18 de diciembre de 1968. Y comercializado por primera vez en los años 1968 y 1969 por la empresa alemana Partec encargada del desarrollo y producción a través de Phywe AG en Gotinga. En aquel tiempo los métodos de absorción electromagnética tenían el favor de la comunidad científica sobre los métodos fluorescentes. Poco tiempo después comenzó el desarrollo comercial de los citómetros de flujo, incluyendo el citofluorógrafo (1971) de la empresa Bio/Physics Systems Inc. (más tarde Ortho Diagnostics), el PAS 8000 (1973) de la empresa Partec, y el primer dispositivo FACS de Becton Dickinson (1974), el ICP 22 (1975) de Partec/Phywe y el Epics de la Coulter Corporation en 1977/78.
Origen del nombre de la técnica El nombre original de la citometría de flujo era "citofotometría de pulso" (en Alemán: Impulszytophotometrie), que fue el nombre publicado en la primera patente de aplicación práctica de la citometría de flujo fluorescente. Recién en la 5.ª Conferencia sobre Citometría Automatizada de la American Engineering Foundation realizada en Pensacola, Florida en 1976 -ocho años después de la presentación del primer citómetro de flujo fluorescente (1968)- se acordó utilizar el nombre de citometría de flujo, un término que rápidamente ganó popularidad.
Principio miniatura|300px|Esquema de disposición de elementos en un citómetro de flujo. Una fuente emisora de luz monocromática, usualmente un haz de luz láser (A) envía un rayo que es colimado (L1) y enfocado (L2) por medio de lentes sobre la cámara de flujo laminar (C), luego de atravesar la cámara el rayo de luz directa es detenido por una pantalla (s), mientras que la luz dispersada es enfocada por otra lente (L3) sobre un fotodiodo (D1), esto constituye el detector de dispersión frontal (FSC). La luz dispersada lateralmente y la fluorescencia se enfocan por medio de una lente sobre un espejo dicroico (M) que refleja la mayor parte de la luz de igual longitud de onda a la producida por la fuente (A), atraviesa un filtro (F1) e incide sobre un detector. Esto constituye el sistema de detección de dispersión lateral (SSC).La luz que no es reflejada por el espejo dicroico, ya que tiene una longitud de onda diferente a la emitida, lo atraviesa e incide sobre un filtro interferencial (F2) que puede ser ajustado para una determinada longitud de onda, discriminando así entre diferentes fluoróforos, para finalmente incidir sobre un tubo fotomultiplicador (D3), esto constituye el detector lateral de fluorescencia (SFL).
Un rayo de luz monocromático, usualmente de luz láser, es dirigido hacia un finísimo chorro de líquido hidrodinámicamente enfocado. Se coloca una serie de detectores en el punto en el que el chorro de líquido atraviesa el rayo de luz. Uno se coloca en línea con el rayo de luz (a este detector se lo conoce como FSC, por Forward Scatter o detector de Dispersión Frontal), y varios angularmente a la trayectoria del rayo (a estos se los conoce como SSC, por Side Scatter, o detectores de Dispersión Lateral); además de uno o más detectores de fluorescencia. Cada una de las partículas suspendidas con un tamaño de entre 0,15 a 0,20 micrómetros que atraviesan el rayo de luz lo dispersan, y las sustancias químicas fluorescentes que se encuentran dentro o adheridas a la partículas son excitadas hasta emitir luz a una longitud de onda mayor que la de la fuente de luz. Esta combinación de luz dispersada y fluorescencia es recogida por los detectores, y por medio de un análisis en la fluctuación de la intensidad luminosa recogida por cada detector, es posible derivar varios tipos de información acerca de la estructura física y química de cada partícula individual.
El detector frontal o FSC brinda información acerca del volumen de la partícula, mientras que los detectores laterales o SSC brindan información acerca de la complejidad interna de la misma (por ejemplo la forma del núcleo celular, la cantidad y tipo de gránulos citoplasmáticos o la rugosidad de la membrana plasmática). Esto se debe a que los componentes internos de las células dispersan la luz. Algunos de los citómetros de flujo presentes en el mercado han eliminado la necesidad de un detector de fluorescencia y utilizan tan sólo la información de luz dispersada para las mediciones. Otros citómetros de flujo son capaces de generar gráficos de los datos obtenidos de la fluorescencia de las células, luz dispersada y luz transmitida.
miniatura|Aspecto del frente de un citómetro de flujo - en este caso se trata del Fluorescence activated cell sorter (FACSCalibur) de Becton-Dickinson
Citómetros de flujo Los citómetros de flujo modernos son capaces de analizar varios miles de partículas por segundo, en tiempo real, y pueden separar y aislar activamente partículas de acuerdo a propiedades específicas. Un citómetro de flujo es en cierta forma similar a un microscopio, salvo que, en vez de producir imágenes de las células, los citómetros de flujo ofrecen una cuantificación automática de una serie de parámetros con altísima calidad. Para analizar tejidos sólidos es posible preparar en primera instancia una suspensión de células.
Un citómetro de flujo tiene cinco componentes principales: La celda de flujo laminar, donde el líquido circulando en régimen de flujo laminar acarrea y pone en línea a las células de modo que pasen a través del rayo de luz de a una y en fila. Un sistema de medición, los más comúnmente utilizados son la medición de la impedancia o conductividad (principio Coulter) y los sistemas ópticos. Un sistema de iluminación formado ya sea por lámparas de alta luminosidad (de mercurio, xenón), láseres de alta potencia refrigerados por agua (de argón, de criptón, de tinturas), láseres de baja potencia refrigerados por aire (de argón λ 488 nm), láser rojo de helio-neón (λ 633 nm), verde de helio-neón, ultravioleta de helio-cadmio; láseres de diodo de baja potencia (azul, verde, rojo, violeta). Un detector y un conversor de señales ADC (análogo a digital), los cuales registran la señal producida (sea FSC, SSC, SFL) y la convierten en una señal eléctrica que puede ser procesada por un computador. Un sistema de amplificación, lineal o logarítmico. Un ordenador para el análisis de las señales.
El proceso de recolección de datos a partir de las muestras utilizando un citómetro de flujo es conocido como adquisición. La adquisición es mediada por un software presente en un ordenador físicamente conectado al citómetro de flujo. Este software es capaz de ajustar varios parámetros de la medición, tales como voltaje, compensación, etc. para cada una de las muestras analizadas, y además se encarga de asistir a la presentación inicial de la información de la muestra mientras se realiza la adquisición de los datos para asegurar que los parámetros han sido correctamente ajustados. Los primeros citómetros de flujo eran en su mayoría, dispositivos experimentales, sin embargo los avances técnicos desde su origen han permitido que ahora tengan una gran cantidad de aplicaciones tanto clínicas como de investigación. Debido a estos desarrollos, se ha producido un considerable mercado de instrumentos, software de análisis, y reactivos utilizados tanto en la adquisición como en el marcado fluorescente con anticuerpos.
Los instrumentos modernos en general poseen múltiples láseres y detectores. El récord actual para un instrumento comercial es de siete láseres y 186 detectores de fluorescencia. Al aumentar el número de láseres y detectores, es posible aumentar la cantidad de anticuerpos fluorescentes utilizados para el marcado, permitiendo identificar con mayor precisión la población de interés a través de sus marcadores fenotípicos. Algunos instrumentos pueden incluso tomar fotografías digitales de cada célula, permitiendo analizar si la señal fluorescente se produce dentro o en la superficie de la célula.
Análisis de datos
Gating miniatura|300px|Scatterplot de fluorescencia versus dispersión lateral, de una muestra de sangre entera, el programa ha separado automáticamente las poblaciones basándose en un algoritmo de proximidad a centroides. En color cian se observa la población de neutrófilos + basófilos, en magenta la de linfocitos, en verde monocitos, en rojo la de eosinófilos y por debajo las plaquetas y eritrocitos fantasma Los datos generados por los citómetros de flujo pueden ser dibujados en relación con una variable, en forma de histograma, o en gráficos de puntos (dot-plot) de dos dimensiones y dos o más variables, o incluso en gráficos tridimensionales. Las regiones delimitadas en estos gráficos pueden ser separadas secuencialmente, de acuerdo con la intensidad de la fluorescencia, para crear una serie de subgrupos llamados "gates" (portales). Existen protocolos específicos para hacer la separación en gates, proceso conocido como gating, tanto para propósitos clínicos como diagnósticos.
Los gráficos de citometría con frecuencia se hacen en función de escalas logarítmicas. Ya que los diferentes compuestos fluorescentes utilizados para hacer el marcado poseen espectros de emisión que con frecuencia se solapan, las señales recogidas por los detectores deben ser compensadas tanto electrónica como computacionalmente. Los datos acumulados por los citómetros pueden ser analizados utilizando diferentes softwares, tales como por ejemplo WinMDI (el único que es freeware), Flowjo, FCS Express, VenturiOne, CellQuest Pro, o Cytospec. Una vez que se han recogido los datos, no se hace necesario que la computadora siga conectada al citómetro, razón por la cual la mayor parte de las veces el análisis de datos se hace en otro ordenador. Esto se hace especialmente necesario en instalaciones centrales donde la utilización de estas máquinas se encuentra bajo alta demanda.
Análisis computacional