La aconitasa (ACO) o aconitato hidratasa () es una enzima que cataliza la isomerización estereoespecífica de citrato a isocitrato a través de cis-aconitato en el ciclo de Krebs. En los humanos, encontramos la aconitasa citosólica (ACO1) y la aconitasa mitocondrial (ACO2); estas dos proteínas son isoenzimas. Ambas variantes son proteínas multifunción (en inglés, "moonlightning proteins"), es decir, proteínas formadas por una única cadena polipeptídica que tienen más de una función.
Biosíntesis El gen humano de la Aconitasa 1 se encuentra en el cromosoma 9, tiene una longitud de entre 66.217 y 70.150 pares de bases y la región codificante es de 44.605 pares de bases, un total de 20 exones. El mRna correspondiente tiene una longitud cercana a las 3.500 bases y mediante el proceso de traducción y las modificaciones postraduccionales se obtiene una proteína de 889 aminoácidos.
En el caso de la Aconitasa 2 humana, el gen correspondiente se encuentra en el cromosoma 22 y se extiende aproximadamente sobre 59.860 pares de bases y 18 exones y la región codificante es de 59.467 pares de bases, un total de 18 exones. La proteína resultante está formada por 753 aminoácidos.
Estructura La aconitasa es una enzima que pertenece a las proteínas ferrosulfuradas. La estructura secundaria está constituida por hélices alfa alternadas con láminas beta y, por lo que a la estructura terciaria refiere, la aconitasa es una proteína globular. No dispone de estructura cuaternaria ya que solo tiene una subunidad.
Su estructura está dividida en 4 dominios globulares presentados con el siguiente orden: 4, 1, 2 y 3. Entre los dominios 3 y 4 hay un linker joining (estructura proteica) que varía dependiendo de la conformación funcional. En la aconitasa citosólica es más largo y estructurado (593 a 654) que en la mitocondrial (513 a 536). El sitio activo está formado por 21 aminoácidos de los cuatro dominios. Las cadenas laterales son polares y forman enlaces de hidrógeno con el sustrato, lo que contribuye al gran tamaño de la proteína. Los dominios del 1 al 3 están muy compactados, a diferencia del cuarto que es mucho más flexible. Existe un plegamiento que difiere en ambos tipos en el dominio 1 para la región N-terminal, residuos del 1 al 33. Las inserciones en diferentes dominios provoca que las estructuras tridimensionales de las dos isoenzimas (citosólica y metabólica) sean distintas.
Cuando la proteína cataliza la isomerización del citrato a D-isocitrato, si está inactiva, contiene un grupo [3Fe-4S] en el sitio activo, mientras que, para que la aconitasa esté activa y realice esta función, se debe ligar un átomo más de hierro, creando un grupo [4Fe-4S]2+. En cambio, cuando la proteína desempeña funciones relacionadas con el ARN mensajero, no presenta ninguno de los dos grupos mencionados. La pérdida del grupo formado por átomos de hierro y azufre provoca un cambio en la conformación, resultando en un sitio activo con una mayor abertura, permitiéndole así tener un sustrato diferente.
Clasificación
Aconitasa citosólica La cAcn interconvierte el citrato e 2 en el citoplasma, lo cual permite equilibrar la cantidad de NADPH obtenido por la deshidratación de isocitrato y la cantidad de acetil-coA generado a partir de citrato. Estos dos productos son necesarios para la síntesis de ácidos grasos y numerosos procesos metabólicos, como la glucólisis o la gluconeogénesis.
A su vez, la actividad enzimática del cAcn parece contribuir en la defensa celular contra el estrés oxidativo al proporcionar una fuente de isocitrato para la producción de NADPH. Glutatión reductasa utiliza el NADPH para regenerar glutatión tras ser oxidada por glutatión peroxidasa, lo cual permite retirar el peróxido creado por el estrés oxidativo.
Contiene un clúster de hierro-azufre [4Fe-4S] con el que la aconitasa adopta una conformación cerrada alrededor del centro activo que le permite enlazarse con el citrato y catalizar la conversión a isocitrato. Sin embargo, la aconitasa solo tiene actividad catalítica cuando las concentraciones de hierro son altas (en niveles normales). Si las concentraciones de hierro bajan demasiado, entonces la cAcn pierde el [4Fe-4S] -clúster y su actividad enzimática, y asume un nuevo papel en la regulación de los niveles de hierro dentro de la célula. De este modo, se obtiene la proteína IRP-1, con la capacidad de unirse a secuencias específicas no codificantes del mRNA, relacionada con la captación, el almacenamiento y la utilización de hierro, y conocidas como elementos de respuesta de hierro (Iron-responsive element (IRE)). Una vez vinculado a estas secuencias, el IRP-1 ejerce una regulación postranscripcional, ya sea promoviendo o impidiendo su traducción. Estos sitios de unión generalmente coinciden con los sitios de unión al clúster de hierro y azufre.La fuerte interacción asegura la homeostasis de hierro en células mamíferas ante una escasez de hierro.
La cAc en mamíferos ha desarrollado una función secundaria como inhibidor de esos mRNA que transportan elementos de respuesta o reguladores de hierro (IRE).
Otra proteína reguladora del hierro, el IRP2, carece de actividad enzimática como aconitasa, pero es el principal regulador metabólico del hierro, uniéndose a los mismos ARNm que el IRP-1. Por el contrario, el IRP1 actúa predominantemente como aconitasa, cambiando a IRP1 en niveles altos de oxígeno, posiblemente en condiciones de infección o inflamación, donde la producción de especies reactivas de oxígeno y óxido nítrico podría desestabilizar el cúmulo del clúster hierro-azufre.
Aconitasa mitocondrial miniaturadeimagen|426x426px|Ilustración de aconitasa mitocondrial ACO2 (cerdo) con isocitrato como complejo y FeS4 como grupo, ambos ilustrado en esferas. Estructura secundaria coloreada por dominio. La mAcn juega un papel fundamental en el metabolismo de los carbohidratos, pues cataliza el segundo paso del ciclo de Krebs para producir isocitrato a partir de citrato. También cumple una función estructural y reguladora en el mantenimiento del ADN mitocondrial (mtDNA): actúa en la estabilización del mtDNA, formando parte de los complejos proteicos de este, conocidos como nucloides. El mtDNA modela los nucloides para influir directamente en la expresión genética mitocondrial ante cambios en el entorno celular.
Estas dos funciones están vinculadas. La función en el ciclo de Krebs es proporcionar electrones de alta energía en forma de NADH y FADH2 a la vía de fosforilación oxidativa mitocondrial, mientras que el mtDNA codifica componentes de la vía de fosforilación oxidativa. Como tal, mAcn podría actuar como un regulador metabólico para acoplar el metabolismo energético con la expresión del gen mitocondrial.
Es una proteína muy conservada y presenta una gran homología entre mamíferos. Además es susceptible a la acetilación no enzimática por metabolitos como el acetil-CoA, por lo que funcionaría como sensor de la disponibilidad de nutrientes.
A pesar de presentar numerosas similitudes estructurales con la aconitasa citosólica, los dominios poseen una configuración diferente. En el dominio 1, se observa un plegamiento diferente para la región N-terminal (residuos del 1 al 33) al comparar las dos proteínas y, a su vez,el linker joining en la aconitasa citosólica (593 a 654) es más largo que en la mitocondrial (513 a 536), y además se encuentra más estructurado. Además, cuando se compara con la aconitasa mitocondrial, en la aconitasa citosólica aparecen inserciones en diferentes dominios: tres en el dominio 1, dos en el dominio 3 y una en el dominio 4 otra más es. Por lo tanto, las estructuras tridimensionales de estas dos isoenzimas son significativamente distintas.
Aconitasa bacteriana Al igual que la mAcn, la aconitasa bacteria (AcnB) es una enzima principal en el ciclo de Krebs que posee una función secundaria. En la bacteria Escherichia coli, se demostró que la AcnB es un regulador de la expresión genética. En Salmonella enterica, la AcnB inicia un proceso regulador para controlar la biosíntesis de flagelos mediante una interacción del ftsH transcript, un factor sigma alternativo de la RNA polimerasa.
Esta unión disminuye la concentración intracelular de ftsH proteasa y, consecuentemente, aumenta la cantidad del factor sigma 32 de la RNA polimerasa, el cual en la mayoría de los casos es degradado por la ftsH proteasa. Dicho factor aumenta la síntesis del chaperón Dnak, lo cual fomenta la síntesis de la proteína flagelar FliC.
Asimismo regula la síntesis de otras proteínas , como el superóxido dismutasa (SodA) y otras enzimas involucradas en el estrés oxidativo. Tiene una estructura de dominio diferente a la de cAcn o mAcn, y difiere de otras aconitasas al contener un dominio similar a HEAT. Se cree que los dominios de tipo HEAT están involucrados en las interacciones proteína-proteína. La región N-terminal, que contiene tanto el dominio tipo HEAT como el dominio "giratorio", son responsables de la dimerización y la unión de AcnB al ARNm.
Un mecanismo de dimerización mediado por hierro puede ser responsable de cambiar AcnB entre sus funciones catalíticas y reguladoras, ya que la dimerización requiere hierro, mientras que la unión del ARNm es inhibida por el hierro.
Escherichia coli también posee aconitasa A (AcnA), que es una enzima inducida por el estrés sintetizada durante la fase estacionaria de crecimiento. La AcnA es similar en la conformación de dominios a la mAcn eucariota.
Función Centro activo de la enzima izquierda|miniaturadeimagen|364x364px|Ilustración del centro activo de aconitasa (PDB 7ACN) con isocitrato como ligando (las interacciones con los puentes de hidrógeno se marcan en línea de puntos). Al contrario que la mayoría de las proteínas hierro-azufre, que funcionan como transportadores de electrones, el centro hierro-azufre de la aconitasa reacciona directamente con el sustrato de una enzima. La aconitasa tiene un centro activo [Fe4S4]2+, que puede convertirse a una forma inactiva [Fe3S4]+. Estabiliza el sustrato por medio de interacciones electroestáticas, colocándolo en la posición correcta para interactuar con los residuos catalíticos, y se garantiza el anclaje del sustrato a la enzima por la presencia de aminoácidos como la serina (Ser), arginina (Arg), histidina (His) o ácido aspártico (Asp). Se ha demostrado que tres residuos de cisteína (Cys) son ligandos del centro [Fe4S4]: Cys437, Cys503 y Cys506. Por tanto, en el centro activo del enzima existen aminoácidos responsables de la unión y el anclaje del sustrato al enzima, a lo que también contribuye el centro ferro-sulfurado, y, por otro lado, tenemos aminoácidos encargados de llevar a cabo la catálisis propiamente dicha. La conformación cerrada que adopta la aconitasa con el clúster de [Fe4S4] lo que ocasiona es una restricción de accesibilidad a este clúster. Se cree que el acceso a este centro activo es a través de un movimiento del dominio 4 de la proteína con respecto al resto de dominios (tal y como ocurre en la aconitasa mitocondrial).
Los residuos que forman el centro activo son conservados entre especies de animales, plantas, bacterias y levaduras. En las bacterias, la aconitasa se une al ARN viral, estabilizándolo y promoviendo la traducción de proteínas virales, mientras que en las levaduras es importante para el mantenimiento y asociación del ADN mitocondrial mediante la formación de nucleoides.
La Ser642 es capaz de aceptar el protón que cede el sustrato actuando como base, gracias al entorno químico en que se encuentra. Por otro lado, la His101actúa como un ácido, donando su protón para la reacción. En estado activo, los lábiles iones de hierro del centro [Fe4S4] no están coordinados por Cys, sino por moléculas de agua.