thumb|300px|Un espécimen histológico teñido, colocado entre portaobjetos y cubreobjetos, montado sobre la platina de un microscopio óptico.
Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar orgánulos dentro de células individuales.
En bioquímica, esto implica agregar un colorante específico (esto significa que se una de manera selectiva ya sea a ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tinción como el marcado fluorescente pueden servir para los mismos propósitos.
Diferentes tipos de tinciones biológicas son utilizadas también para marcar células en citometría de flujo y para marcar proteínas o ácidos nucleicos en electroforesis en gel.
Las tinciones no están limitadas a su uso en materiales biológicos, también pueden ser utilizadas para estudiar la morfología de otros materiales (por ejemplo, las estructuras lamelares de polímeros semicristalinos de las estructuras de dominio de bloques de copolímeros).
Tinción in vivo e in vitro Una tinción in vivo (tinción vital) es el proceso de teñir tejidos vivos. Al provocar que determinadas células o estructuras adquieran los colores de contraste, se puede estudiar su ubicación y morfología mientras están desempeñando su función. El propósito más común es revelar detalles de la citoestructura que de otra manera no resultarían evidentes, sin embargo, la tinción vital puede revelar además dónde aparece un determinado producto químico o dónde se lleva a cabo una determinada reacción química dentro de las células o tejidos.
A menudo estas tinciones son llamadas tinciones vitales. Se introducen en el organismo mientras las células aún se encuentran vivas. Para conseguir el efecto deseado, el colorante usualmente se utiliza en soluciones muy diluidas que van entre 1:5.000 a 1:50.000. A pesar de esto las tinciones son eventualmente tóxicas para los organismos, algunas más que otras.
Una tinción in vitro o "supravital" involucra el coloreo de células o estructuras que han sido removidas de su contexto biológico. Se utiliza a menudo una combinación de varios colorantes para revelar más detalles y características de las que se obtendrían con la utilización de uno solo. Combinados con protocolos específicos de fijación y de preparación de muestras, los científicos y profesionales de la salud pueden utilizar estas técnicas estandarizadas como una herramienta diagnóstica repetible y consistente. Una contratinción es una tinción que consigue que las células o estructuras sean más visibles, cuando no se consigue que sean totalmente visibles con la tinción principal.
Por ejemplo, el cristal violeta tiñe únicamente a las bacterias Gram positivas en la tinción de Gram. Se utiliza una contratinción de safranina (que colorea todas las células), para permitir también la identificación de bacterias Gram negativas.
Es de notar que muchas tinciones pueden ser utilizadas tanto en células vivas como en células fijadas.
Métodos de tinción in vitro Preparación Las etapas preparatorias involucradas en una tinción van a depender del tipo de análisis planeado; bajo estas premisas se puede considerar que algunos o todos de los siguientes pasos podrían requerirse.
Fijación: de por sí, esta etapa puede consistir en varios pasos. La fijación es una modificación de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas que forman una célula o tejido y que tiene por finalidad preservar las formas de las células o tejidos tanto como sea posible. A veces se puede utilizar una fijación por calor para matar, adherir y alterar un espécimen de modo que acepte la tinción. La mayor parte de las veces se utiliza un fijador químico. Los fijadores químicos en general causan la formación de enlaces cruzados entre proteínas, o entre proteínas y otras sustancias presentes en la muestra, incrementando su resistencia mecánica. Entre los fijadores químicos más comunes se encuentran el formaldehído, etanol, metanol, y/o el ácido pícrico. Pequeños bloques de tejido pueden ser embebidos en parafina o algún polímero, proceso conocido como inclusión, para incrementar su resistencia y estabilidad, y para hacer más fácil cortarlos en rodajas extremadamente delgadas, ya que cuanto más delgado es un corte histológico, más definición se obtiene en las imágenes microscópicas.
Permeabilización este paso implica el tratamiento de las células con un surfactante suave. Este tipo de tratamiento tiene como finalidad disolver la membrana celular para permitir que las grandes moléculas de colorante puedan acceder a las estructuras del interior de las células.
Montaje frecuentemente implica adherir los cortes histológicos a un portaobjetos de vidrio para su observación al microscopio o análisis. En algunos casos, se puede cultivar a las células directamente sobre el portaobjetos. En muestras de células sueltas, como las que se presentan en un extendido de sangre o de fluidos biológicos, la muestra puede ser aplicada directamente sobre el portaobjetos. Para piezas de tejido de mayor tamaño, se utiliza un micrótomo que corta la muestra en rodajas sumamente delgadas. Estas rodajas son luego adheridas al portaobjetos por medio de una substancia que funciona como pegamento, ya sea una resina transparente, gelatina o clara de huevo. El montaje tiene por finalidad aumentar la resistencia mecánica de una muestra que de otra manera sería extremadamente frágil, para que soporte el proceso de teñido conservando lo más posible su estructura original.
Tinción adecuada En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la muestra (antes o después de la fijación y el montaje) en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante y la observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente, esto es, un compuesto químico que reacciona con el colorante para formar un precipitado coloreado insoluble. Cuando la solución de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tinción mordentada permanece.
La mayoría de los colorantes utilizados en microscopía se encuentran disponibles como colorantes certificados. Esto significa que los colorantes ofrecidos por el fabricante han sido evaluados por un organismo independiente, la Biological Stain Commission, y que este organismo ha determinado que el producto ofrecido cumple o excede ciertos estándares de pureza, concentración de sustancia colorante y desempeño en las técnicas de tinción empleadas. Estos estándares son publicados detalladamente en la revista Biotechnic & Histochemistry.Penney, D. P., Powers, J. M., Frank, M., Churukian, C. (2002) «Analysis and testing of Biological Stains - the Biological Stain Commission Procedures.» Biotechnic & Histochemistry 77: 237-275. Muchos colorantes presentan una composición diferente entre diferentes fabricantes. La utilización de colorantes certificados elimina una fuente de resultados inesperados.Horobin, R. W., Kiernan JA (2002) Conn's Biological Stains. A Handbook of Dyes Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine. 10th ed. Oxford: BIOS. ISBN 1-85996-099-5
Tinción directa Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo.
Tinción indirecta Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual es el ácido tánico.
Afinidad de diferentes tejidos por diferentes colorantes Cuando un tejido u estructura subcelular presenta una afinidad por un determinado colorante se suele designar por los sufijos -filo o -fílico. Por ejemplo, los tejidos que se tiñen con azure suelen ser nombrados como azurófilos o azurofílicos. También puede ser utilizado para designar propiedades tintoriales más generalizadas, por ejemplo los tejidos que se tiñen con colorantes de naturaleza ácida (por ejemplo la eosina) suelen ser denominados como acidofílicos, basofílicos cuando se tiñen con colorantes de naturaleza básica (tales como por ejemplo el azul de metileno o la hematoxilina), y anfifílicos cuando aceptan ambos colorantes.thefreedictionary.com > amphophilic Citing: Saunders Comprehensive Veterinary Dictionary, 3 ed. 2007 Elsevier, Inc. Por el contrario, los tejidos cromófobos no toman colorante con facilidad.
Tinción negativa Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los métodos de tinción positiva fallan, es la tinción negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser observados fácilmente por medio de microscopía en campo claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea.Clark, G. (1981) Staining Procedures, 4th ed. p. 412. Baltimore: Williams & Wilkins. Adicionalmente, la tinción negativa es una técnica suave que no destruye a los microorganismos, permitiendo por lo tanto un recultivo posterior para el estudio de patógenos.
Colorantes La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.
Colorantes histológicos más comunes Los diferentes colorantes reaccionan o se concentran en diferentes partes de las células o tejidos, y estas propiedades son utilizadas como una ventaja para revelar partes o áreas específicas. Algunos de los colorantes biológicos más comunes se listan más abajo. A menos que se indique lo contrario la mayoría de estos colorantes se utilizan con células y tejidos fijados. Las tinciones vitales (que pueden ser utilizadas con organismos vivos) se encuentran destacadas.
Azul brillante de Coomassie