La prueba de la gota en liquenología es un análisis puntual que se usa para ayudar a identificar líquenes. Se realiza colocando una gota de un reactivo químico en diferentes partes del liquen y observando el cambio de color (o la falta del mismo) asociado con la aplicación del químico. Las pruebas se encuentran rutinariamente en claves dicotómicas para especies de líquenes, y aprovechan la amplia gama de productos de líquenes (metabolitos secundarios) producidos por los líquenes y su singularidad entre los taxones. Como tal, las pruebas puntuales revelan la presencia o ausencia de sustancias químicas en varias partes de un liquen. Fueron propuestos por primera vez como un método para ayudar a identificar especies por el liquenólogo finlandés William Nylander en 1866.
Tres pruebas puntuales comunes usan una solución acuosa de KOH al 10% (prueba K), una solución acuosa saturada de polvo blanqueador o hipoclorito de calcio (prueba C) o una solución alcohólica de p-fenilendiamina al 5% (prueba P). Los cambios de color se producen debido a la presencia de metabolitos secundarios particulares en el liquen. En la literatura de referencia clave de identificación, el resultado de las pruebas químicas puntuales sirve como característica principal para determinar las especies de líquenes. Hay varias otras pruebas puntuales de uso menos frecuente y de uso más limitado que se emplean en situaciones específicas, como para distinguir entre ciertas especies. Las variaciones de la técnica, incluido el uso de papel de filtro para mejorar la visibilidad de las reacciones o el examen al microscopio, se adaptan a diferentes tipos de líquenes y pigmentaciones, y los resultados generalmente se resumen con un código corto que indica la sustancia y la reacción observadas. Otros métodos de diagnóstico, como la exposición a la luz ultravioleta (UV), pueden ayudar a identificar los metabolitos del liquen y distinguir entre especies, ya que algunas sustancias emiten fluorescencia bajo los rayos UV, lo que ayuda a diferenciar especies estrechamente relacionadas.
Pruebas miniaturadeimagen|390x390px|Pruebas puntuales en el liquen folioso Punctelia borreri mostrando talo (arriba) y médula (abajo). El cambio de color rojo rosado de la médula en las pruebas C y KC indica la presencia de ácido girofórico, una característica química que ayuda a distinguirlo de especies similares en el mismo género. Son cuatro las pruebas de la gota que se usan con mayor frecuencia para ayudar con la identificación de líquenes.
Prueba k El reactivo para la prueba K es una solución acuosa de hidróxido de potasio (KOH) (10-25%) o, en ausencia de KOH, una solución acuosa al 10% de hidróxido de sodio (NaOH, lejía), que proporciona resultados casi idénticos. Una solución al 10% de KOH conservará su efectividad durante aproximadamente 6 meses a un año. La prueba depende de la formación de sal y requiere la presencia de al menos un grupo funcional ácido en la molécula. Los compuestos de liquen que contienen una quinona como parte de su estructura producirán un color rojo oscuro a violeta. Los compuestos de ejemplo incluyen los pigmentos que son antraquinonas, naftoquinonas y terfenilquinonas. Los colores amarillo a rojo se producen con la prueba K y algunos depsides (incluidos atranorina y ácido tamnólico), y muchas β-orcinol depsidonas. Por el contrario, las xantonas, los derivados del ácido pulvínico y el ácido úsnico no tienen ninguna reacción.
Algunos líquenes comunes y ampliamente distribuidos que tienen productos de liquen con una reacción positiva a K incluyen Xanthoria parietina, que es K+ (rojo púrpura) debido a la parietina (una antraquinona), y Dibaeis baeomyces, que es K + (amarillo) debido al compuesto didépsido ácido baeomicésico.
Prueba c Esta prueba usa una solución saturada de hipoclorito de calcio (polvo blanqueador) o, alternativamente, una solución diluida (generalmente se usa 5.25%) de hipoclorito de sodio o lejía doméstica sin diluir. Estas soluciones generalmente se reemplazan a diario, ya que se descomponen en 24-48 horas; se descomponen aún más rápidamente cuando se exponen a la luz solar (menos de una hora) y, por lo tanto, se recomienda guardarlas en una botella de color oscuro. Otros factores que aceleran la descomposición de estas soluciones son el calor, la humedad y el dióxido de carbono.
Los colores típicamente observados con la prueba C son rojo y naranja-rosa. Los productos químicos que causan una reacción roja incluyen ácido anziaico, eritrina y ácido lecanórico, mientras que los que producen un rojo anaranjado incluyen ácido girofórico. En raras ocasiones, se produce un color verde esmeralda, causado por la reacción con dihidroxidibenzofuranos,como la estrepsilina química. Otro color raro producido por esta prueba es el amarillo, que se observa con Cladonia portentosa como resultado del ácido úsnico dibenzofurano.
Algunos líquenes comunes y ampliamente distribuidos que tienen productos de líquenes con una reacción positiva a C incluyen Lecanora expallens, que es C+ (naranja) debido al ácido xantona tiofánico, y Diploschistes muscorum, que es C+ (rojo) debido al ácido diploschistésico didépside.
Prueba de DP miniaturadeimagen|p-fenilendiamina. Esto también se conoce como la prueba P. Utiliza una solución etanólica de parafenilendiamina (PD) al 1-5%, elaborada colocando una gota de etanol (70-95%) sobre unos pocos cristales del químico; esto produce una solución inestable y sensible a la luz que dura aproximadamente un día. Una forma alternativa de esta solución, llamada solución de Steiner, es mucho más duradera, aunque produce reacciones de color menos intensas. Por lo general, se prepara disolviendo 1 gramo de PD, 10 gramos de sulfito de sodio y 0,5 mililitros de detergente en 100 mililitros de agua; inicialmente de color rosado, la solución se vuelve púrpura con la edad. La solución de Steiner durará meses. La fenilendiamina reacciona con aldehídos para producir bases de Schiff de acuerdo con la siguiente reacción:
R−CHO + H2N−C6H4−NH2 → R−CH=N−C6H4−NH2 + H2O
Los productos de esta reacción son de color amarillo a rojo. La mayoría de las depsidonas de β-orcinol y algunos depsidos de β-orcinol reaccionarán positivamente. La prueba PD, conocida por su alta especificidad hacia las sustancias que producen reacciones K+ amarillas o rojas, ha reemplazado en gran medida a la prueba K más simple pero menos concluyente. La DP es venenosa tanto en polvo como en solución, y las superficies que entran en contacto con ella (incluida la piel) se decolorarán.
Algunos líquenes comunes y ampliamente distribuidos que tienen productos de líquenes con una reacción positiva a P incluyen Parmelia subrudecta, que es PD+ (amarilla) debido a la atranorina dépsido, e Hypogymnia physodes, que es PD + (naranja) debido al ácido fisodálico depsidona.
Prueba de KC Esta prueba se puede realizar humedeciendo el talo con K seguido inmediatamente por C. La aplicación inicial de K descompone (mediante hidrólisis) los enlaces éster en los depsidos y depsidonas. Si se libera un grupo hidroxilo fenólico que es meta a otro hidroxilo, entonces se produce un color rojo a naranja a medida que se aplica C. El ácido alectorónico y el ácido fisódico producen este color, mientras que se produce un color violeta cuando está presente el ácido picrolicénico. La prueba CK es una variación menos utilizada que invierte el orden de aplicación de los productos químicos. Se usa en casos especiales cuando se analiza el color naranja producido por el ácido barbático o el ácido difractaico, como está presente en Cladonia floerkeana. El yodo de Lugol es otro reactivo que puede ser útil para identificar ciertas especies.
Hipogimnia tubulosa es un liquen que es KC+ (naranja-rosa) debido al ácido fisódico depsidona; Cetrelia olivetorum es KC+ (rosa-rojo) debido al ácido depsidona alectorónico.
Pruebas menos comunes Hay varias pruebas de la gota que se usan con poca frecuencia debido a su aplicabilidad limitada, pero pueden ser útiles en situaciones en las que es necesario detectar metabolitos particulares de liquen o distinguir entre ciertas especies cuando otras pruebas son negativas.
Una solución al 10% de hidróxido de bario (Ba(OH)2) da un color violeta cuando se prueba con ácido diploesquistésico, un químico que se encuentra en algunas especies de Diploesquistes. Una solución saturada de peróxido de bario (BaO2), cuando se prueba con ácido olivetórico, se volverá de un color amarillo que se volverá verde después de unos minutos. Una solución al 1% (peso por volumen) de cloruro férrico (FeCl3) en etanol produce varios colores posibles cuando se prueba con compuestos que tienen grupos fenólicos. La prueba de N usa una solución al 35% de ácido nítrico, que se puede usar para distinguir especies de Melanelia de especies marrones de Xantoparmelia. La prueba S utiliza una solución de ácido sulfúrico (0,5% a 10%) aplicada con brocha sobre una muestra seca extraída con acetona de un liquen talo, seguido de calentamiento a la llama durante 30 segundos o hasta que se desarrolle el color. Un color violeta persistente a rosa brillante indica la presencia de ácido miríquídico y puede usarse para distinguir entre los dos líquenes de nieve morfológicamente similares, Stereocaulon alpinum y S. groenlandicum, sin tener que recurrir a análisis químicos más laboriosos. La prueba de Beilstein implica calentar una pequeña muestra de la sustancia a analizar en un alambre de cobre; los compuestos halogenados causan un color de llama verde intenso temporal. Un reactivo de anisaldehído, cuando se calienta con extractos de acetona, produce un color magenta con ácido úsnico, aunque los ácidos meroclorofaéicos también dan una reacción roja similar.
Realización de las pruebas de la gota miniaturadeimagen|350x350px|Pruebas químicas puntuales en liquen crustoso y saxícola Aspicilia epiglypta. Las pruebas de la gota se realizan mediante la colocación de una pequeña cantidad de reactivo deseado en la parte de los líquenes a ser probado. A menudo, tanto en la corteza y la médula de los líquenes son probados, y, a veces, es útil para probar otras estructuras tales como el soredio. Es un método para extraer una pequeña cantidad de la sustancia química en un tubo capilar de vidrio y toca el liquen talo; un pequeño pincel también es utilizada para este propósito. Las reacciones pueden visualizarse mejor con una lupa o un microscopio estéreo. Una hoja de afeitar se puede utilizar para quitar la corteza y el acceso a la médula. Alternativamente, la solución puede ser aplicada a liquen características que carecen de una corteza o que salen de la médula expuesta, tales como soredio, pseudocyphellae, o la parte inferior de las escamas.
En una variación de esta técnica, sugerida por el químico sueco Johan Santesson, se usa un trozo de papel de filtro para tratar de hacer que la reacción del color sea más fácilmente observable. El fragmento de liquen se presiona sobre el papel y las sustancias líquenas se extraen con 10-20 gotas de acetona. Después de evaporar la acetona, las sustancias líquenas se dejan en el papel en un anillo alrededor del fragmento de liquen. El papel de filtro puede entonces someterse a prueba puntual de la manera habitual. En los casos en que los resultados de una prueba puntual en el talo son inciertos, es posible aplastar una sección delgada del tejido en un portaobjetos de microscopio con una cantidad mínima de agua y reactivo debajo de un cubreobjetos. Un cambio de color es visible bajo un objetivo de microscopio de baja potencia, o cuando el portaobjetos se coloca sobre un fondo blanco. Esta técnica es útil cuando se analizan líquenes con pigmentos oscuros, como Bryoria.