La enzima 4-hidroxibenzoato 3-monooxigenasa (), también conocida comúnmente como p-hidroxibenzoato hidroxilasa (PHBH), es una flavoproteína perteneciente a la familia de las oxidorreductasas (EC 1). Es una monooxigenasa (EC 1.14), específicamente una hidroxilasa dependiente de NADH (EC 1.14.13) una de las enzimas más estudiadas y cataliza reacciones involucradas en la desintoxicación del suelo, el metabolismo y otros procesos biosintéticos.
La 4-hidroxibenzoato 3-monooxigenasa cataliza la hidroxilación regioselectiva del 4-hidroxibenzoato, dando como producto el 3,4-dihidroxibenzoato. El mecanismo consta de los siguientes pasos generales:
(1) reducción de la flavina (2) reacción de la flavina con O2, produciendo C2-hidroperoxiflavina, (3) unión y activación del sustrato, lo que lleva a la formación y liberación del producto.
A lo largo del mecanismo, la flavina cambia entre conformaciones "abierta" y "cerrada", alterando así el entorno de reacción del sustrato. La conformación abierta permite el acceso del disolvente al sitio activo; la enzima adopta esta conformación para la unión del sustrato y la liberación del producto. Una conformación cerrada aísla la reacción del disolvente, lo que ayuda a estabilizar los intermedios de reacción. izquierda|miniaturadeimagen|650px|La conversión enzimática de 4-hidroxibenzoato a 3,4-dihidroxibenzoato
Estructura La 4-hidroxibenzoato 3-monooxigenasa es un homodímero con una flavina enlazada a cada monómero. El sitio activo está compuesto por la flavina y los residuos de aminoácidos del monómero. La estructura de esta enzima se suele utilizar como modelo para la interdependencia estructura-reactividad de otras hidroxilasas dependientes de flavina. El sitio activo limita los posibles sustratos a bencenos sustituidos, concretamente 4-hidroxibenzoato (el sustrato nativo), 2,4-dihidroxibenzoato, 4-mercaptobenzoato y varios compuestos aromáticos halogenados.
Mecanismo miniaturadeimagen|El sustrato se mantiene en su lugar mediante varias interacciones no covalentes con el armazón de proteína. La hidroxilasa, 4-hidroxibenzoato 3-monooxigenasa, procede a través de un proceso catalítico que comienza con la entrada de NADPH y 4-hidroxibenzoato (el sustrato nativo) en el sitio activo de la enzima. Esto resulta en la formación de un complejo enzima-flavina-sustrato-NADPH, después de lo cual el cofactor de flavina, FAD, es reducido por NADPH. NADP + se pierde y O 2 entra en el complejo, seguido de la oxidación de la flavina para formar un hidroperóxido, que actúa como el reactivo de transferencia de hidróxido. Es importante notar que mientras que el grupo transferido se conoce como hidróxido es formalmente un grupo OH +. Este hidróxido es transferido al sustrato desde el hidroperóxido flavina, flavina-C4a-hidroperóxido, a través de una reacción de tipo sustitución aromática electrófila . Finalmente, el producto sale del complejo y la hidroxi-flavina es deshidratada, regenerando FAD y permitiendo que el proceso se repita.
El sustrato se une al sitio activo de la enzima mediante interacciones no covalentes con las cadenas laterales proximales de los aminoácidos. Específicamente, los grupos hidroxilo de las tirosinas 201 y 222, además del grupo hidroxilo de la serina 212, interactúan con los grupos carboxilato e hidroxilo del sustrato. Esto permite una correcta orientación dentro del sitio activo para lograr reactividad.
Una vez unido el sustrato, la flavina cambia de una conformación abierta a una cerrada. Esto protege el sitio activo y el sustrato del disolvente, previniendo la degradación prematura del hidroperóxido de flavina. La unión del NADPH y el sustrato cambia la enzima a una conformación externa. Esto ocurre mediante una intrincada red de protones dentro de la enzima que permite la desprotonación del fenol y un subsiguiente cambio dinámico de la enzima. La conformación externa alinea el anillo de isoaloxazina de la flavina para que pueda ser reducido rápidamente por el NADPH. Tras la reducción, se libera NADP + de la enzima.
La reducción de la flavina genera una especie con carga negativa, FADH −, que es atraída por el sitio activo con carga positiva. Esta atracción devuelve la flavina a la conformación "cerrada", aislándola del entorno del disolvente. Este aislamiento proporciona un entorno y una posición óptimos para que el O 2 hidroxile el sustrato. El oxígeno se une a FADH − mediante una transferencia de un solo electrón, que es el paso limitante de la velocidad de la reacción. Esto forma un radical FAD e hidroperóxido de flavina. La reacción entre estos genera C4a-peroxiflavina, que se protona rápidamente para formar flavina-C4a-hidroperóxido. La tautomerización conduce a la formación de 3,4-dihidroxibenzoato. El paso final del mecanismo es la disociación del producto y el agua del FAD, lo que hace que la flavina vuelva a la conformación abierta.
Referencias
Categoría:Enzimas de estructura conocida Categoría:EC 1.14.13