Un sitio de unión al ADN es un tipo de sitio de unión ubicado en el ADN como una región especifica de nucleótidos donde otras moléculas pueden unirse. Se distinguen de otros sitios de unión en que forman parte de una secuencia de ADN y están unidos por proteínas de unión al ADN. Los sitios de unión al ADN ayudan a la regulación transcripcional gracias a que estos sitios se vinculan a proteínas especificas conocidas como factores de transcripción. El conjunto de todos los sitios de unión en el ADN que son específicos para unirse a un factor de transcripción se denomina cistroma. Además de los factores de transcripción los sitios de unión al ADN también pueden ser blanco de otras proteínas, como las enzimas de restricción, las recombinasas específicas y las metiltransferasas.
Los sitios de unión al ADN son secuencias cortas de ADN, conformadas por 4 a 30 pares de bases (hasta 200 pares de bases para los sitios de recombinación) donde una misma secuencia puede estar unida específicamente a una proteína o a un complejo de proteínas de unión al ADN, formando así, interacciones proteína-ADN cruciales para regular la expresión génica. Se ha informado que algunos sitios de unión tienen el potencial de experimentar un cambio evolutivo rápido.
Historia La existencia de algo parecido a sitios de unión del ADN se sospechó a partir de los experimentos sobre la biología del bacteriófaga lambda y la regulación del operón lac de Escherichia coli. Los sitios de unión del ADN finalmente se confirmaron en ambos sistemas con el advenimiento de las técnicas de secuenciación de ADN. Desde entonces, se han descubierto sitios de unión al ADN para muchos factores de transcripción, enzimas de restricción y recombinasas específicas del sitio utilizando una profusión de métodos experimentales.
Tipos de sitios de unión al ADN Algunos autores han propuesto que los sitios de unión pueden clasificarse según su modo de representación más conveniente, sin embargo, también pueden categorizarse según su función biológica. Por lo tanto, al evaluarse se pueden distinguir entre sitios de unión de restricción, factores de transcripción y de recombinación.
Por un lado, los sitios de restricción son secuencias específicas del ADN que reconocen y seleccionan las endonucleasas de restricción.Mücke, M.; Reuter, M.; Krüger, D. (2006). Restriction endonucleases, method of synthesis and use thereof (US7106972B2). United States. https://patents.google.com/patent/US7106972B2. Estás enzimas hacen cortes escalonados en el sitio de reconocimiento o cerca de él que producen extremos sobresalientes de cadena sencilla Autores han propuesto que la síntesis de una endonucleasa de restricción con un sitio de unión al ADN, ocurre cuando una proteína de restricción con un dominio C-terminal y un dominio N-terminal se une a dos sitios de unión al ADN, mediante escisión proteolítica en ambos dominios o mediante clonación del segmento génico que codifica los dominios, su expresión y la selección de los dominios endonucleolíticos con un sitio de unión al ADNEstos sitios pueden representarse generalmente mediante secuencias consenso ya que las enzimas restringen de manera eficiente cuando se dirigen a secuencias idénticas y la eficiencia de la restricción disminuye abruptamente para secuencias menos similares.
Los sitios de unión a factores de transcripción, llamados también, reguladores transcripcionales, se conforman por un sitio de unión al ADN y un sitio efector que activa o reprime la transcripción. Por lo que suelen ser todos diferentes y con diversos grados de afinidad del factor de transcripción por los distintos sitios de unión. Esto dificulta la representación precisa de los sitios de unión de factores de transcripción utilizando secuencia consenso, y normalmente se representan utilizando matrices de frecuencia específicas de posición (PSFM), que a menudo se representan gráficamente utilizando logotipos de secuencias. Las enzimas de restricción y los factores de transcripción producen un rango gradual y agudo de afinidades para diferentes sitios y, por lo tanto, también se representan mejor mediante PSFM. De igual manera, las recombinasas específicas del sitio también muestran un rango variado de afinidades para diferentes sitios objetivo. Estos sitios están influenciados principalmente por proteínas específicas de unión al ADN, como RAD51 y PRDM9, recombinasas importantes en eucariotas que al unirse al ADN monocatenario forman filamentos de nucleoproteínas, PRDM9 es una proteína de dedo de zinc que determina los puntos calientes de recombinación en mamíferos al unirse a una secuencia de 13 nucleótidos para el intercambio de ADN entre dos cromosomas homólogos.
Representación de los sitios de unión al ADN
Una colección de sitios de unión al ADN para un factor de transcripción (TF), comúnmente conocida como motivo de unión al ADN, puede representarse de diferentes maneras. La forma más sencilla es la secuencia consenso, que se crea seleccionando la base más frecuente en cada posición de un conjunto de secuencias de unión alineadas. Aunque esta representación tiene la ventaja de ser compacta, omite información sobre la variabilidad en cada posición A veces, algunas posiciones en los sitios de unión no muestran una preferencia definida por un nucleótido, sino que admiten más de una base o incluso cualquier base. En estos casos se pueden utilizar los códigos de ambigüedad de la IUPAC, que permiten representar posiciones donde se acepta más de una base. + IUPAC-IUB8 de las recomendaciones de códigos de una sola letra Nomenclatura IUPAC A C G T R Y W S M K H B V D N Nucleótidos representados A C G T A, G C, T A, T C, G A, C G, T A, C, T C, G, T A, C, G A, G, T A, C, G, T
Una forma más precisa de representar los sitios de unión al ADN es a través de una Matriz de Frecuencia Específica de Posición (PSFM, por sus siglas en inglés: Position Specific Frequency Matrix). Estas matrices proporcionan información sobre la frecuencia de cada base (A, C, G, T) en cada posición del motivo de unión al ADN. Generalmente, se asume implícitamente que hay independencia posicional (es decir, que las diferentes posiciones en el sitio de unión contribuyen de manera independiente a la función del sitio), aunque esta suposición ha sido cuestionada en algunos casos. La información de frecuencia contenida en una PSFM puede interpretarse formalmente mediante el marco teórico de la Teoría de la información lo que da lugar a una representación gráfica conocida como Logotipo de secuencias o logo de secuencias (sequence logo).
Por ejemplo, la siguiente tabla representa una PSFM derivada de 23 sitios de unión del represor transcripcional LexA según datos de Prodoric. Esta matriz muestra el número de veces que aparece cada base (A, C, G, T) en cada posición de una serie de secuencias alineadas. Se obtiene directamente del conteo de secuencias.
Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16NucleótidosA 0 0 0 1 17 1 16 7 14 7 16 4 12 1 21 1 C 22 0 0 0 1 3 0 1 2 6 3 5 10 22 0 0G 0 0 23 3 0 0 4 1 2 0 0 1 0 0 1 22 T 1 23 0 19 5 19 3 14 5 10 4 13 1 0 1 0Suma 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23
A partir de la PSFM, se crea la matriz de probabilidad de posición (PPM, por sus siglas Position Probability Matrix), que muestra la frecuencia relativa (probabilidad) de cada base en cada posición. Se obtiene dividiendo cada valor del PSFM entre el número total de secuencias (en este caso, 23). Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16NucleótidosA 0 0 0 0.04 0.74 0.04 0.700.300.610.300.700.170.520.040.910.04 C 0.96 0 0 0 0.04 0.13 00.040.090.260.130.220.430.9600G 0 0 1 0.13 0 0 0.170.040.09000.04000.040.96 T 0.04 1 0 0.83 0.22 0.83 0.130.610.220.430.170.570.0400.040Suma 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 A partir de estos datos podemos obtener la matriz de pesos posicionales (PWM, por sus siglas en inglés: Position Weight Matrix). A diferencia de la PSFM, este modelo asigna un "peso" a cada base en cada posición, el cual se mide en bits y refleja la contribución que realiza cada base a la especificidad del sitio. Este modelo está basado en la teoría de la información, por lo que se utiliza la entropía de Shannon y para cada columna, se mide la incertidumbre o variabilidad:
Donde representa la incertidumbre en la posición del motivo representada en bits, es la frecuencia de la base de ADN en dicha posición. Posteriormente se calcula el contenido de Información (eje y) para cada columna de posición , que es la diferencia entre la máxima entropía posible (2 bits para ADN) y la incertidumbre observada :
Finalmente la altura de cada base en la matriz es su frecuencia multiplicada por el contenido de información total de esa columna, es decir, :
Siguiendo los pasos anteriores se llega a las siguientes tablas para el ejemplo del represor LexA:
y para cada posición: Posición123456789101112131415160.26000.8110.811.191.351.531.551.191.581.210.260.510.261.74221.1911.190.810.650.470.450.810.420.791.741.491.74
Matriz de Pesos Posicionales (PWM): Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16NucleótidoA 0 0 0 0.05 0.74 0.05 0.570.200.290.140.570.070.410.081.360.08 C 1.67 0 0 0 0.04 0.16 00.030.040.120.110.090.341.6700G 0 0 2 0.16 0 0 0.140.030.04000.02000.061.67 T 0.08 2 0 0.98 0.22 0.98 0.110.390.100.200.140.240.0300.060Suma 1.74 2 2 1.19 1 1.19 0.81 0.65 0.47 0.45 0.81 0.42 0.79 1.74 1.49 1.74 thumb|derecha|400px|Logo de secuencia del motivo de unión a LexA de Escherichia coli. La altura representa el contenido de información (véase Teoría de la información) de la posición medida en bits. Extraído de la base de datos Prodoric. Los logos de secuencias se derivan de la PWM y pueden utilizarse para representar sitios de unión al ADN conservados, donde se unen los factores de transcripción. La altura de cada letra en el logo es proporcional a su frecuencia, y la altura total representa el contenido de información en esa posición. La secuencia consenso mostrada en la imagen de la derecha representa las bases más frecuentes en cada posición del motivo de unión.
Técnicas experimentales para la identificación de sitios de unión a ADN Históricamente, las técnicas experimentales de elección para descubrir y analizar los sitios de unión del ADN han sido el ensayo de huella de ADNasa y el ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA). Sin embargo, el desarrollo de microarrays de ADN y técnicas de secuenciación rápida ha dado lugar a nuevos métodos masivamente paralelos para la identificación in vivo de sitios de unión, como ChIP-chip y ChIP-Seq. Para cuantificar la afinidad de unión de proteínas y otras moléculas a sitios de unión de ADN específicos se utiliza el método biofísico termoforesis a microescala.
En años recientes, técnicas de edición genómica como CRISPR/dCas9 se ha combinado con secuenciación (CRISPR-ChIP) para mapear interacciones proteína-ADN con mayor precision y resolución espacial. Además, métodos como HiChIP e integraciones con ATAC-seq han permitido estudiar no solo los sitios de union, sino también los cambios en la accesibilidad de la cromatina y su dinámica durante procesos celulares como la diferenciación y respuesta de estímulos externos. Estas herramientas han revolucionado el campo de la epigenómica funcional y la biología reguladora, permitiendo construir mapas tridimensionales del genoma que relacionan sitios de unión con potenciadores distales y estructuras como bucles cromatínicos.