La secuenciación paralela masiva es cualquiera de los enfoques de alto rendimiento para la secuenciación de ADN que utilizan el concepto de procesamiento paralelo masivo; también se denomina secuenciación de próxima generación (NGS, por sus siglas en inglés Next-Generation Sequencing) o secuenciación de segunda generación.
Algunas de estas tecnologías aparecieron entre 1993 y 1998, han sido comercialmente accesibles desde 2005.Patente US - número 5641658, 1997-06-24, Método para realizar la amplificacion de acido nucleico con dos cebadores unidos a un solo soporte solido, concedida a Mosaic Technologies Inc.| y Whitehead Institute for Biomedical Research, inventor: Adams CP, Kron SJPatente EP - número 0972081, Método de amplificación de ácidos nucleicos, 2007-06-13 concedida a Solexa Ltd., inventor Farinelli L, Kawashima E, Pascal MayerPatente EP- número 0975802, Método de secuenciación de ácidos nucleicos, 2004-06-23, |inventores =Kawashima E, Farinellit L, Pascal Mayer Estas tecnologías utilizan plataformas miniaturizadas y un paralelo para la secuenciación de 1 millón a 43 mil millones de lecturas cortas (50 a 400 bases cada una) por ejecución de instrumento.
Muchas plataformas NGS difieren en los diseños de ingeniería y la química de secuenciación.
Ambos utilizan plantillas de ADN amplificadas por clonación y espacialmente separadas o moléculas de ADN individuales en una celda de flujo para realizar una secuenciación paralela masiva.
La secuenciación de Sanger, a veces denominada secuenciación capilar o secuenciación de primera generación, se basa en la separación electroforética de productos de terminación de cadena generados en procesos de secuenciación individuales. Este diseño es sustancialmente diferente al de la secuenciación de Sangery permite completar la secuenciación a mayor escala.
Plataformas NGS Podemos clasificar las plataformas de NGS de dos formas, según como se secuencie y como de larga sea la lectura que se secuencie: Por un lado pueden ser métodos basados, o no, en síntesis (de nuevas hebras de ADN), y por otro lado, métodos de larga lectura o de corta lectura ("long read" vs "short read"). Cada método tendrá sus ventajas y desventajas.
Los métodos basados en síntesis cometen menos errores de secuenciación, pero no permiten obtener información extra de la secuencia secuenciada (modificación de bases como por ejemplo la metilación). Los métodos no basados en síntesis (ejemplo, Oxford NanoPore), permiten analizar secuencias de ADN, o incluso ARN, y analizar las modificaciones de las bases de esa secuencia.
Los métodos de lectura corta tienen una capacidad enorme de producción de datos, pudiendo secuenciar genomas enteros en muy poco tiempo en algunos casos, pero no pueden saber si varios fragmentos de ADN secuenciados provienen de la misma fuente. Un ejemplo de este tipo de tecnología sería Illumina. Esto es una desventaja cuando, por ejemplo, se está estudiando la variabilidad genética de un virus. Interesa saber qué mutaciones están asociadas a otras dentro de cada genoma viral, y para eso es preferible leer la secuencia completa de un virus en una sola lectura (miles de bases). PacBio y Oxford NanoPore serían ejemplos de tecnologías de lectura larga (una de síntesis y la otra de no síntesis, respectivamente).
En general, la secuenciación del ADN mediante síntesis se lleva a cabo utilizando plataformas NGS disponibles comercialmente siguiendo los pasos que se enumeran a continuación. En primer lugar, se utiliza la amplificación clonal in vitro mediante PCR para crear bibliotecas de secuenciación de ADN. En segundo lugar, en lugar de usar la química de terminación de cadena para identificar la secuencia de ADN, el ADN se secuencia mediante síntesis, en cuyo caso se agregan nucleótidos a la cadena complementaria.
En tercer lugar, sin necesidad de separación física, las plantillas de ADN amplificadas y separadas espacialmente se secuencian en paralelo de manera masiva y simultánea. La mayoría de las plataformas NGS de síntesis siguen estos pasos, pero cada una lo hace de manera diferente.
En una ejecución de un solo instrumento, la paralelización NGS de las reacciones de secuenciación produce cientos de Megabases (Mb) a Gigabases (Gb) de lecturas de secuencias de nucleótidos. Como resultado, la cantidad de datos de secuencias accesibles ha aumentado drásticamente, lo que produjo cambios significativos en la forma en que las ciencias biomédicas abordan la secuenciación del genoma.
Las nuevas tecnologías e instrumentos de NGS han contribuido aún más a una disminución significativa en el costo de la secuenciación, acercándose a la marca de $1000 por secuenciación del genoma.
En la tabla se resumen las plataformas de secuenciación masiva en paralelo disponibles para el comercio a partir de 2014 y sus características. A medida que el ritmo de las tecnologías NGS avanza rápidamente, las especificaciones técnicas y los precios cambian. miniaturadeimagen| Una máquina secuenciadora Illumina HiSeq 2000 +Plataformas NGS Plataforma Preparación de plantillas Química Longitud máxima de lectura (bases) Tiempos de ejecución (días) Gb máximo por ejecución Roche 454 Clonal-emPCR Pirosecuenciación 400‡ 0.42 0,40-0,60 GS FLX Titanio Clonal-emPCR Pirosecuenciación 400‡ 0.42 0.035 Illumina MiSeq Amplificación de puente clonal Terminador de tinte reversible 2x300 0.17-2.7 15 Illumina HiSeq Amplificación de puente clonal Terminador de tinte reversible 2x150 0.3-11 1000 Analizador del genoma de Illumina III Amplificación de puente clonal Terminador de tinte reversiblePatente US-número 7790869, Método paralelo masivo para decodificar ADN y ARN, 2010-09-07, asignada a Trustees of Columbia University in the City of New York, inventores=Ju J, Li Z, Edwards JR, Itagaki Y 2x150 2-14 95 Life Technologies SOLiD4 Clonal-emPCR Ligación encadenada de oligonucleótidos 8-mer 20-45 4-7 35-50 Protón de iones de Life Technologies Clonal-emPCR dNTP nativos, detección de protones 200 0.5 100 Genómica completa Nanobolas de ADN cuadriculadas Ligación desencadenada de oligonucleótidos 9-mer 7x10 11 3000 Heliscopio de Biociencias Helicos Molécula única Terminador de tinte reversible 35‡ 8 25 SMRT de Biociencias del Pacífico Molécula única Nucleótidos fluorescentes fosfoenlazados 10,000 ( N50 ); 30,000+ (máximo) 0.08 0.5 Se indican los tiempos de ejecución y la salida de Gigabase (Gb) por ejecución para la secuenciación de un solo extremo. Los tiempos de ejecución y las salidas se duplican aproximadamente cuando se realiza una secuenciación de extremos emparejados. ‡ Longitudes de lectura promedio para las plataformas Roche 454 y Helicos Biosciences.
Métodos de preparación de plantillas para NGS Se utilizan dos métodos para preparar plantillas para reacciones de NGS: plantillas de moléculas de ADN individuales y plantillas amplificadas que se originan a partir de moléculas de ADN individuales. Para los sistemas de imágenes que no pueden detectar eventos de fluorescencia únicos, se requiere la amplificación de las plantillas de ADN. Los tres métodos de amplificación más comunes son la PCR en emulsión (emPCR), el círculo rodante y la amplificación en fase sólida. La distribución final de las plantillas puede ser espacialmente aleatoria o en cuadrícula.
PCR en emulsión En los métodos de PCR en emulsión, primero se genera una biblioteca de ADN a través de la fragmentación aleatoria del ADN genómico. Los fragmentos de ADN monocatenario (plantillas) se unen a la superficie de las perlas con adaptadores o enlazadores, y una perla se une a un solo fragmento de ADN de la biblioteca de ADN.
La superficie de las perlas contiene sondas de oligonucleótidos con secuencias que son complementarias a los adaptadores que unen los fragmentos de ADN. Luego, las perlas se compartimentan en gotitas de emulsión de agua y aceite. En dicha emulsión acuosa, cada una de las gotitas que capturan una perla es un microrreactor de PCR que produce copias amplificadas de la plantilla de ADN única.
Nanobolas de círculo rodante cuadriculadas La amplificación de una población de moléculas de ADN individuales mediante la amplificación de círculo rodante en solución es seguida por la captura en una cuadrícula de puntos de tamaño más pequeño que los ADN que se van a inmovilizar.Patente US, número 6485944, Amplificación de réplicas de matrices de ácidos nucleicos, 2002-11-26, asignada President and Fellows of Harvard College, inventor=Church GM, Mitra RPatente US. número=8445194, Matrices de moléculas individuales para análisis genético y químico. 2013-05-21. asignada=Callida Genomics Inc. inventor=Drmanac R, Callow MJ, Drmanac S, Hauser BK, Yeung G
Generación de colonias de ADN (amplificación de puente) Los cebadores directo e inverso se unen covalentemente a alta densidad al portaobjetos en una celda de flujo. La relación entre los cebadores y la plantilla sobre el soporte define la densidad superficial de los grupos amplificados. La celda de flujo se expone a reactivos para la extensión basada en polimerasa, el cebado se produce cuando el extremo libre o distal de un fragmento ligado forma un "puente" con un oligonucleótido complementario en la superficie. La desnaturalización y la extensión repetidas dan como resultado la amplificación localizada de fragmentos de ADN en millones de ubicaciones separadas en la superficie de la celda de flujo. La amplificación en fase sólida produce entre 100 y 200 millones de grupos de plantillas separados espacialmente, lo que proporciona extremos libres a los que luego se hibrida un cebador de secuenciación universal para iniciar la reacción de secuenciación.
Esta tecnología fue presentada para una patente en 1997 del Instituto de Investigación Biomédica de Ginebra (GBRI) de Glaxo-Welcome, por Pascal Mayer, Eric Kawashima y Laurent Farinelli, y se presentó públicamente por primera vez en 1998. En 1994, Chris Adams y Steve Kron presentaron una patente sobre un método de amplificación de superficie similar, pero no clonal, llamado "amplificación puente" adaptado para la amplificación clonal en 1997 por Church y Mitra.
Plantillas de una sola molécula Los protocolos que requieren amplificación de ADN a menudo son engorrosos de implementar y pueden introducir errores de secuenciación. La preparación de plantillas de una sola molécula es más sencilla y no requiere PCR, que puede introducir errores en las plantillas amplificadas. Las secuencias diana ricas en AT y GC a menudo muestran un sesgo de amplificación, lo que da como resultado su subrepresentación en las alineaciones y ensamblajes del genoma. Las plantillas de una sola molécula generalmente se inmovilizan en soportes sólidos utilizando uno de al menos tres enfoques diferentes:
En el primer enfoque, las moléculas de cebador individuales distribuidas espacialmente se unen covalentemente al soporte sólido. La plantilla, que se prepara fragmentando aleatoriamente el material de partida en tamaños pequeños (por ejemplo,~200–250 pb) y agregando adaptadores comunes a los extremos del fragmento, luego se hibrida con el cebador inmovilizado. En el segundo enfoque, las plantillas de una sola molécula distribuidas espacialmente se unen covalentemente al soporte sólido cebando y extendiendo plantillas de una sola molécula de una sola hebra a partir de cebadores inmovilizados. A continuación, se hibrida un cebador común con el molde. En cualquier enfoque, la ADN polimerasa puede unirse a la configuración de la plantilla cebada inmovilizada para iniciar la reacción de NGS. Los dos enfoques anteriores son utilizados por Helicos BioSciences.