Las tecnologías de transcriptómica son las técnicas utilizadas para el estudio del transcriptoma de un organismo, es decir, el conjunto de todos sus transcritos de ARN. La información contenida en un organismo se guarda en el ADN de su genoma y se expresa mediante la transcripción. Entonces, el ARNm sirve como una molécula intermediaria y transitoria en la red de información, mientras que los ARNs no codificantes cumplen con diferentes funciones adicionales. Un transcriptoma refleja una foto fija en el tiempo de los transcritos totales presentes en una célula. Las tecnologías de transcriptómica permiten saber qué procesos celulares se encuentran activos y cuáles inactivos. Uno de los principales retos de la biología molecular es comprender cómo un único genoma origina variedad de células. Otro es cómo se regula la expresión génica.
Los primeros intentos en estudiar transcriptomas completos comenzó al comienzo de la década de 1990. Desde finales de esta década, los subsiguientes avances tecnológicos han transformado repetidamente el campo y hecho de la transcriptómica una disciplina generalizada en las ciencias biológicas. Existen dos técnicas actuales clave en este campo: microarrays, los cuales cuantifican un conjunto de secuencias predeterminadas, y ARN-Seq, el cual utiliza secuenciación de alto rendimiento para registrar todos los transcritos. Conforme la tecnología ha mejorado, el volumen de datos producidos por cada experimento de transcriptómica se ha incrementado. Como resultado, los métodos de análisis de datos se han adaptado continuamente para analizar, de manera más precisa y eficiente, grandes volúmenes de datos. Las bases de datos transcriptómicos también se han ampliado y se han vuelto más útiles a medida que los investigadores continúan coleccionando y compartiendo transcriptomas. Sin el conocimiento de experimentos previos, sería imposible interpretar la información contenida en un transcriptoma.
La medición de la expresión de los genes de un organismo en tejidos, condiciones o momentos diferentes, aporta información sobre cómo los genes se regulan y revela detalles de la biología de un organismo. También se puede utilizar para inferir las funciones de genes previamente no anotados. Los análisis del transcriptoma han permitido el estudio de cómo la expresión génica cambia en diferentes organismos y ha sido crucial en la comprensión de las enfermedades humanas. Un análisis completo de la expresión génica hace posible la detección de tendencias amplias y coordinadas que no pueden discernirse de otra forma mediante ensayos más específicos.
Historia miniaturadeimagen| Uso de métodos de transcriptómica a lo largo del tiempo. Artículos publicados sobre ARN-Seq (negro), microarrays de ARN (rojo), marcadores de secuencia expresada (EST) (azul), visualización diferencial digital (DDD) (verde) y análisis en serie/cap de la expresión génica (amarillo), desde 1990.|300x300px La transcriptómica se ha caracterizado por el desarrollo de nuevas técnicas, las cuales han redefinido cada década lo que es posible y han convertido en obsoletas tecnologías previas. El primer intento en capturar el transcriptoma humano de manera parcial fue publicado en 1991 e informó de 609 secuencias de ARNm del cerebro humano. En 2008 se publicaron dos transcriptomas humanos, compuestos de millones de secuencias derivadas de transcritos y cubriendo 16 000 genes. En 2015, se habían publicado transcriptomas de cientos de individuos. Actualmente, se generan continuamente transcriptomas de diferentes enfermedades, tejidos o incluso de células únicas. El rápido desarrollo de nuevas tecnologías con sensibilidad mejorada y más baratas ha posibilitado esta explosión en transcriptómica.
Antes de la transcriptómica Varias décadas antes de que estuviera disponible cualquier estrategia de transcriptómica, ya se realizaban estudios de transcritos individuales. A finales de la década de 1970, se coleccionaron transcritos de ARNm de la mosca de seda, convirtiéndolos a ADN complementario (ADNc) para almacenamiento mediante transcriptasa inversa. En los años 1980, la secuenciación de bajo rendimiento utilizando el método de Sanger se utilizó para secuenciar transcritos al azar, produciendo marcadores de secuencias expresadas (ESTs). El método de secuenciación de Sanger predominaba hasta la llegada de los métodos de alto rendimiento, tales como la secuenciación por síntesis (Solexa/Illumina). Las secuencias ESTs se convirtieron en las predominantes durante los años 1990 como un método eficiente para determinar el contenido de genes de un organismo sin secuenciar el genoma completo. Multitud de métodos permitieron cuantificar transcritos individuales, tales como northern blot, matrices de membrana de nailon y PCR cuantitativa tras transcriptasa inversa (RT-qPCR). Sin embargo, estos métodos son laboriosos y solo pueden capturar una pequeña subsección del transcriptoma. Consecuentemente, la manera en que un transcriptoma en su conjunto se expresa y regula permaneció desconocida hasta el desarrollo de las técnicas de alto rendimiento.
Primeros intentos El término transcriptoma se utilizó por primera vez en la década de los años 1990. En 1995, se desarrolló uno de los primeros métodos de secuenciación basados en transcriptómicas , el análisis seriado de expresión génica (SAGE), la cual funcionaba mediante secuenciación de Sanger de fragmentos transcritos concatenados al azar. Los transcritos se cuantificaron comparando los fragmentos con genes conocidos. También se utilizó en un breve espacio de tiempo una variante de SAGE, que utiliza técnicas de secuenciación de alto rendimiento, denominada análisis de expresión génica digital. Sin embargo, estos métodos fueron rápidamente reemplazados por la secuenciación de alto rendimiento de transcritos completos, lo cual proveía de información adicional sobre la estructura de los transcritos, por ejemplo, variantes de empalme alternativo.
Desarrollo de técnicas contemporáneas. +Comparación de métodos contemporáneosARN-Seq Microarray Rendimiento 1-7 días por experimento 1-2 días por experimento Cantidad de ARN de entrada Bajo ~ 1 ng de ARN total Alto ~ 1 μg de ARNm Intensidad de trabajo Alto (preparación de muestras y análisis de datos) Bajo Conocimiento previo No se requiere ninguno, aunque conocer una secuencia de genoma/transcriptoma de referencia es útil Se requiere un genoma/transcriptoma de referencia para el diseño de sondas Precisión en la cuantificación ~90 % (limitado por la cobertura de la secuencia) >90 % (limitado por la precisión de detección de fluorescencia) Resolución de secuencia ARN-Seq puede detectar SNPs y variantes de empalme (limitado por la precisión de secuenciación de ~99 %) Las matrices especializadas pueden detectar variantes de empalme de ARNm (limitado por el diseño de la sonda y la hibridación cruzada) Sensibilidad 1 transcrito/millón (aproximado, limitado por la cobertura de la secuencia) 1 transcrito/mil (aproximado, limitado por detección de fluorescencia) Rango dinámico 100 000:1 (limitado por la cobertura de secuencia) 1000:1 (limitado por la saturación de fluorescencia) Reproducibilidad técnica >99 % >99 % Las técnicas predominantes actualmente, los microarrays y el ARN-Seq, se desarrollaron en la mitad de la década de 1990 y de 2000. En 1995 se publicaron por primera vez microarrays capaces de medir la abundancia de un conjunto definido de transcritos mediante su hibridación en una matriz de sondas complementarias. La tecnología de microarray permitió el ensayo de miles de transcritos simultáneamente y a un coste considerablemente reducido por gen y con ahorro de trabajo manual. Tanto las matrices de oligonucleótidos individuales como las de alta densidad de Affymetrix fueron los métodos preferidos para la elaboración de perfiles transcripcionales hasta finales de la década de 2000. Durante este periodo, se produjeron una serie de microarrays para abarcar genes conocidos de organismos modelo o de importancia económica. Los avances en el diseño y fabricación de matrices mejoraron la especificidad de las sondas y permitieron analizar más genes en un única matriz. Los avances en la detección por fluorescencia aumentaron la sensibilidad y la precisión de las mediciones de transcritos de baja abundancia.
El ARN-Seq se realiza mediante la transcripción inversa in vitro del ARN y la secuenciación del ADNc resultante. La abundancia de los transcritos se obtiene a partir del número de recuentes de cada transcrito. Por lo tanto, la técnica está altamente influenciada por el desarrollo de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. La secuenciación masiva en paralelo (MPSS) fue un ejemplo temprano basado en la generación de secuencias de 16-20 pares de base mediante series complejas de hibridaciones,En biología molecular, la hibridación es un fenómeno en el que las moléculas de ácido desoxirribonucleico de cadena simple (ADN) o de ácido ribonucleico (ARN) se combinan formando ADN o ARN complementario. y se utilizó en 2004 para validar la expresión de 10 000 genes en Arabidopsis thaliana. El primer proyecto de ARN-Seq se publicó en 2006 con 1000 transcritos secuenciados utilizando tecnología 454. Esto fue suficiente cobertura para cuantificar la abundancia relativa de los transcritos. El ARN-Seq comenzó a ser a popular después de 2008 cuando nuevas tecnologías Solexa/Illumina permitieron registrar mil millones de secuencias de transcritos. Este rendimiento permite ahora la cuantificación y comparación de transcriptomas humanos.
Recopilación de datos La generación de datos sobre los transcritos de ARN es posible mediante dos aproximaciones fundamentales: secuenciación de transcritos individuales (ESTs, o ARN-Seq) o hibridación de una matriz ordenada de sondas de nucleótidos (microarrays).
Aislamiento de ARN Todos los métodos de transcriptómica requieren primero el aislamiento del ARN del organismo experimental antes de poder registrar los transcritos. Aunque los sistemas biológicos son increíblemente diversos, las técnicas de extracción de ARN son muy similares entre sí e involucran la disrupción mecánica de células y tejidos, disrupción de ARNasa con sales caotrópicas, disrupción de macromoléculas u complejos de nucleótidos, separación del ARN de biomoléculas indeseadas incluyendo ADN, y concentración del ARN mediante precipitación de una solución o dilución de una matriz sólida. El ARN aislado puede ser tratado adicionalmente con DNasa para digerir cualquier traza de ADN. Es necesario el enriquecimiento del ARN mensajero, ya que los extractos de ARN total, típicamente, se componen de ARN ribosómico en un 98%. El enriquecimiento de transcritos se puede llevar a cabo mediante métodos de afinidad por la poli-A o por depleción de ARN ribosómico mediante sondas específicas de secuencia. El ARN degradado puede afectar a los resultados posteriores; por ejemplo, el enriquecimiento de ARNm a partir de muestras degradas dará como resultado la depleción de los extremos 5' del ARNm y una señal irregular a lo largo de la longitud de cada transcrito. Es típica la congelación rápida de tejidos previa al aislamiento del ARN. Así se reduce la exposición de las enzimas RNasa una vez que el aislamiento está completo.
Marcadores de secuencia expresada