El ARN CRISPR transactivante o ARNtracr es un fragmento de ARN que interactúa con el sistema de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR). De CRISPR hay muchos tipos, pero nos centraremos en el tipo 2, en el que el tracrRNA usa una secuencia complementaria a este de manera que se permite la maduración del ARNcr con la ayuda del Cas9. El CRISPR proporciona inmunidad adaptiva o adquirida a bacterias y arqueas y el uso de la tecnología con este sistema está siendo muy útil para la edición del genoma. Dentro del ARNtracr encontramos una clasificación que divide en tres grupos las bacterias con un sistema inmunológico CRISPR tipo 2 ya que presentan unos prototipos ligeramente distintos a la estructura original dependiendo de la familia a la que pertenecen. +Clasificación ARNtracrGénero de bacteriasBacteriasEstructura ARNtracrStreptococcusS. sanguinis, S. oralis, S. mitis, S. anginosus B, S. pyogenes, S. dysagalactiae, S. equí, S. thermophilus CRISPR3, S. salivarius, S. gallolycticus, S. lutetiensis249x249pxStreptococcusS. henryi, S. infantarius, S. orisratti, S. vestibularis, S. intermedius, S. mutans, S. thermophilus CRISPR1, S. anginosus A, S. gordonii, S. parasanguinis250x250pxLactobacillusL plantarum, L. pentosus, L. reuteri, L. curvatus, L. fermentum, L. paracasei, L. casei, L. rhamnosus, L. brevis, L. mucosae, L. buchneri A, L. gasseri, L. hominis, L. johnsonii, L. jensenii, L. rossiae, L. delbrueckii, L. coryniformis, L. buchneri B, L. otakiensissinmarco|249x249px

Biosíntesis y genética

Adaptación

El bacteriófago se une a la membrana plasmática de una bacteria (p. ej.:Streptococcus pyogenes) e introduce su material genético o ADN bicatenario al citoplasma celular. Esto conlleva toda una serie de transducción de señales que activan las RNasas (Nucleasas) Cas1 y Cas2, y detectan una secuencia de nucleótidos específica del ADN vírico bicatenario, también conocido como protoespaciador, gracias a una secuencia PAM (Protospacer adjacent motif) que la precede.

Tras la localización de esta secuencia específica, las RNasas Cas1 y Cas2 llevan a cabo el proceso de integración del material genético vírico al ADN bicatenario de la bacteria (Este proceso también es conocido como fase de adaptación). Esta secuencia se convierte en un espaciador característico del virus en el ADN bacteriano con una secuencia CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) adyacente. El conjunto de espaciadores y secuencias CRISPR que se encuentran en el genoma procariota se denomina matriz CRISPR.

Esta matriz CRISPR, en el caso de la bacteria Streptococcus pyogenes, como se trata de un sistema Tipo II-A, estará formada por cinco espaciadores cuyos objetivos serán la endopeptidasa, el superantígeno (speM), la metiltransferasa, la hialuronidasa y una proteína hipotética del fago o bacteriófago. Le sigue, aguas arriba (en sentido 5'), una secuencia líder rica en secuencia AT (Adenina y Timina) que delimita el inicio de la matriz y la separa del operón Cas; formado por los genes codificantes de las proteínas (nucleasas) Cas9, Cas1, Cas2 y Csn2. Seguidamente, se encuentra la secuencia del promotor de transcripción y, finalmente, el gen codificante del ARNtracr; subdividido en una región que codifica para el ARNtracr largo o tracr-L, y en otra que codifica para el ARNtracr corto o tracr-S.

Expresión Ante la falta de investigación sobre este mecanismo, aún no data un sistema de transcripción concreto que determine qué inicia la biosíntesis del ARNtracr. No obstante, se ha tratado de demostrar la coexistencia de dos tipos de sistemas que pueden llevar a cabo la biosíntesis del ARNtracr.

Por un lado, según un estudio basado en la constante observación de la expresión y el procesamiento de los ARNtracr, a raíz de un sondeo de ARN de varias bacterias (Neisseria meningitidis, Streptococcus mutans y Streptococcus thermophilus), se determinó que los respectivos sistemas CRISPR/Cas9 de tipo II se encuentran constitutivamente activos. Como consecuencia, las bacterias que gozan de este sistema presentan una alta respuesta inmunológica ante bacteriófagos que las infecte.

No obstante, por otro lado, sí que existen otros tipos de bacterias dotadas de un represor del promotor de transcripción del locus CRISPR. Este sistema es llevado a cabo por un tipo de ARNtracr salvaje de algunas bacterias (ARNtracr largo o tracr-L) que se pliega en forma de ARNg. y se une a una proteína Cas9 Este, al encontrarse libre, mediante la complementariedad de bases nitrogenadas de una pequeña región de la molécula respecto a una corta secuencia PAM del promotor de transcripción, se une al locus CRISPR y silencia la transcripción (silenciamiento génico transcripcional o TGS) del locus. Por esta misma razón, el tracr-L es capaz de regular la síntesis de las proteínas Cas y del resto de genes del locus De este modo, cuando una célula, en este caso Streptococcus pyogenes, es infectada por un bacteriófago, el represor transcripcional (tracr-L) se libera y permite la activación del promotor para iniciar la transcripción del locus CRISPR. Por esta misma razón, a diferencia del sistema constitutivo de algunas bacterias, la importancia del tracr-L radica en la significativa reducción de probabilidades de padecer enfermedades autoinmunitarias.

Tal y como se representa en la FIGURA 1, la transcripción del operón Cas9 y la matriz CRISPR va en sentido 5'-3', es decir, que la síntesis de ARN es 3'-5'; mientras que la transcripción del gen ARNtracr, que finaliza gracias a la presencia de una Terminación independiente de Rho, es 3'-5', de manera que la biosíntesis del ARNtracr será 5'-3' (en excepción de un gen ARNtracr del sistema CRISPR/Cas9 Tipo II-C).

Como resultado de la transcripción y expresión de genes, se sintetizan un conjunto de ARN's y proteínas que desarrollan la respuesta inmunológica, como ahora el tracr-P (tracr-S procesado o transcrito), las RNasas Cas9, Cas1, Cas2 y Csn2 y el pre-ARNcr (pre-ARN CRISPR).

Localizaciones del gen ARNtracr Como se ha especificado anteriormente, este caso se centra en el sistema CRISPR/Cas9 Tipo II-A del Streptococcus pyogenes. El estudio de los diferentes sistemas CRISPR ha conllevado la aparición de una gran diversidad de sistemas de respuesta inmunitaria de las diferentes bacterias dotadas del sistema CRISPR/Cas9. Por ende, se presenta una gran la variabilidad de los genes codificantes. En otros sistemas CRISPR/Cas Tipo II, como el Tipo II-A del S. thermophilus, el gen codificante del ARNtracr tanto se encuentra aguas arriba del gen Cas9 como justo después de su secuencia. En el caso del Tipo II-B del Francisella Novicida, el gen se encuentra adyacente al operón Cas9 y aguas arriba de la matriz CRISPR. O, en el caso del Tipo II-C del Campylobacter jejuni, que la localización de sus genes ARNtracr se basa en la unión de los modelos de los Tipos II-A y II-B. Estructura y composición química miniaturadeimagen|378x378px|La figura representa una simplificación de la estructura secundaria del ARN guía, un ARN híbrido surgido de la unión, por complementariedad parcial de bases, entre el crARN y el tracrARN. 1. Región de antirrepetición de bases del tracrARN, parcialmente complementaria al crARN. 2. Región de unión del crARN al fragmento del bacteriófago durante el proceso inmunológico. Consta de 20 nucleótidos. El ARNtracr es un pequeño ARN no codificante formado por entre 50 y 171 nucleótidos, por lo que tiene una masa molar de entre 16500-49500 dalton. El número de nucleótidos puede variar tras la maduración del ARNcr (transcrito del gen CRISPR) en la que interviene, ya que puede ser escindido por la RNAsa III la cual regula la maduración del transcrito.

En cuanto a su composición química, el ARNtracr, está formado por la polimerización de nucleótidos mediante la combinación de las bases nitrogenadas A-U, G-C. Se ha establecido un modelo, llamado andamio (scaffold), que establece las bases nitrogenadas que tiene el ARNtracr, aunque puede contener otras dependiendo de la familia de la bacteria.

El modelo base de unión al ARNcr es el siguiente:

5´AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUCG-3’

Alrededor de los primeros 24-25 nucleótidos corresponden a la secuencia de antirrepetición parcialmente complementaria a la secuencia repetidora del ARNcr, a la que se une formando un ARN híbrido conocido como ARN guía o ARNg que se une a la proteína Cas9 para dirigirla hasta el ADN vírico ambas cadenas son necesarias para llevar a cabo esta acción.

La estructura del ARNtracr está definida por 3 loops. En el primer loop se encuentra la secuencia de antirrepetición y el linker de unión al siguiente tramo. Esta zona presenta gran afinidad por la proteína Cas9, en concreto por el dominio Hel-I, rica en arginina, y el dominio CTD. El segundo loop mantiene muchos menos contacto con la proteína y tan solo presenta cierta afinidad por los dominios RuvC y CTD. Por último, en el tercer loop no se ha encontrado ningún tipo de unión con la proteína porque para observar su estructura por cristalografía se ha de prescindir de este. En una visión global, se observa, por tanto, que el sgARN se encuentra entre los dos lóbulos de la proteína Cas9.

Funciones en el sistema CRISPR/Cas9

El ARNtracr media la interacción entre ARNcr y Cas9, endonucleasa asociada a los sistemas CRISPR del tipo II, convirtiéndose así en uno de los componentes esenciales en el sistema inmunitario procariota. El sistema CRISPR II es el que se ha utilizado mayormente como herramienta de edición genética por su simple mecanismo en el cual participan tres componentes siendo el ARNtracr uno principal de ellos junto con la proteína Cas 9 y el ARNcr. La nucleasa Cas9 utiliza como guía a un ARNcr que se aparea con el ARN transactivante, el cual cumple una función principalmente estructural.

Esta función esencial involucrada en la conformación de la estructura del complejo CRISPR se puede desglosar en tres funciones principales; participa en la adquisición del espaciador, dirige la maduración de otro ARN no codificante (pre-ARNcr) mediante la actividad de la enzima RNAasa III para producir la especie activa (ARNcr maduros). Y, por otro lado, ARNtracr también es necesario para la activación y posterior guía de la nucleasa Cas9 para que realice el corte en el ADN diana proveniente del material genético del virus (bacteriófago) inactivándolo y protegiendo a la célula procariota de agentes patógenos invasores.

Mecanismos de reacción en el sistema CRISPR/Cas9 En general, el funcionamiento del sistema CRISPR que proporciona la inmunidad adquirida en bacterias y arqueas, se puede dividir en tres etapas bien diferenciadas: etapa de adquisición, etapa de expresión y etapa de interferencia. Cada uno de los diferentes tipos de sistema CRISPR presenta peculiaridades propias de su biología, pero la ruta de maduración y procesamiento de ARNcr en los sistemas de tipo II, como lo ejemplifica S. pyogenes , difiere significativamente. Se ha demostrado que el proceso requiere una molécula de ARNtracr adicional y depende de la RNasa III de la célula huésped.

Durante la etapa de adquisición en la que se ha captado ADN foráneo del ente invasor (protoespaciador) y se ha incorporado en el locus CRISPR (espaciador) entre las secuencias repetidas y en posición 5´ respecto a la secuencia espaciadora y siempre tras la secuencia líder, el ARNtracr parece estar involucrado en la adquisición del espaciador guiado por la Cas 9, aunque la base mecánica de esta función sigue siendo difícil de alcanzar.