alt=Hplc column|miniaturadeimagen|Columna HPLC (cilindro metálico) montada en un sistema cromatográfico|375x375px La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) (por sus siglas en inglés de High Performance Liquid Chromatography), es una modalidad de cromatografía líquida en columna que se caracteriza por el empleo de rellenos de fase estacionaria de reducido tamaño de partícula (de hasta 3 μm), con lo que se consigue una mejora sustancial en la eficacia separativa, tanto en lo que a resolución de los solutos se refiere, como en lo relativo al tiempo empleado en el análisis, por lo que también se denomina, alternativamente, cromatografía líquida de alta resolución. Dada la importante mejora en las prestaciones, esta modalidad de cromatografía líquida no precisa de largas columnas, siendo lo habitual que estas no excedan de los 25 cm de longitud. Respecto al diámetro de las columnas, estas también son más estrechas que las utilizadas en la modalidad clásica (de 2 a 5 mm de diámetro interno). Esta modalidad de cromatografía es de uso frecuente en el análisis químico y bioquímico.
El empleo de columnas estrechas con rellenos de fase estacionaria de pequeño diámetro de partícula implica una mayor resistencia al paso del eluyente a través de la fase estacionaria, por lo que es necesario emplear elevadas presiones, que pueden llegar a alcanzar las 450 atm (45 MPa) con el fin de obtener caudales constantes de 0,5 a 5 mL/min, es por ello que, a veces, a esta modalidad de cromatografía se le denomina cromatografía líquida de alta presión. Técnicas de HPLC La separación cromatográfica de solutos mediante HPLC puede llevarse a cabo mediante diferentes procedimientos o técnicas. Las más importantes son:
Cromatografía de fase normal La cromatografía de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos sobre la base de su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención.
La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés, sino también en factores estéricos, de forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.
La NP-HPLC cayó en desuso en los años 1970 con el desarrollo de la HPLC de fase inversa o reversed-phase HPLC. En la NP-HPLC existía poca reproducibilidad de los tiempos de retención, puesto que los disolventes próticos cambiaban el estado de hidratación de la gel de sílice o alúmina de la cromatografía. miniaturadeimagen|Micro columna HPLC, con un caudal de trabajo de 1,5uL/min|272x272px
Cromatografía de fase inversa (o reversa) La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) emplea fases estacionarias apolar y fases móviles de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es un líquido unido químicamente a un soporte sólido mediante enlace covalente, por lo que se podría hablar de un pseudo-líquido, dando lugar a la cromatografía de fase ligada. El soporte sólido suele ser gel de sílice tratada con RMe2SiCl, donde la R es una cadena de alcano tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente.
El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada, que a menudo se la denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofóbico está dominado por el aumento de la entropía, y la consecuente disminución de la energía libre, asociada con la minimización de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de partición, de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.
Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la retención. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. Aun así, las moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria, ya que no pueden entrar en los poros más pequeños de la fase estacionaria. El tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al tamaño del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida.
Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmóvil, otras modificaciones de la fase móvil pueden afectar la retención del compuesto; por ejemplo, la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial, y como la entropía de la interfase compuesto-disolvente está controlada precisamente por la tensión superficial, la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención.
Otra variable importante es el pH, puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero también neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar, pero en general mejoran la separación cromatográfica.
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Aun así, muchas columnas de fase reversa están formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso, puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso pero no deberían estar expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las partes metálicas del aparato de HPLC.
Cromatografía bidimensional Es un procedimiento o técnica cromatográfica en el que todos los componentes separados de la muestra, o algunos de ellos, se someten a una etapa de adicional de separación. En la cromatografía líquida de alta eficacia esto se consigue mediante el acoplamiento de dos sistemas cromatógrafos mediante una válvula de desplazamiento de alta presión que permita, en un momento dado, trasferir la muestra desde una columna inicial a una segunda columna donde se completa la separación. La técnica se puede utilizar para una mayor resolución de mezclas complejas que no se pueden separar por completo en un solo medio, para la limpieza de muestras eliminando la matriz o los compuestos que interfieren, para aumentar el rendimiento de la muestra y para el enriquecimiento de trazas de compuestos menores de interés. En la versión más popular de cromatografía bidimensional, solamente uno o un reducido número de compuestos de interés se transfieren al segundo sistema de separación. Sin embargo, en los casos en que se requiere la caracterización completa de mezclas complejas, todos los componentes de la muestra inyectada en la primera columna se transfieren a la segunda columna. En este caso, el proceso se denomina cromatografía bidimensional “integral” (o "completa") y aunque se trata de HPLC, se suele expresar mediante la notación corta LCxLC. En otros casos, el interés analítico esta en la separación y análisis de una parte de la muestra. Es este caso solo se transfiere un grupo de picos desde el primer cromatógrafo al segundo, por lo que el proceso se conoce como cromatografía bidimensional “lineal” o “de corte en corazón”, que generalmente se abrevia con un guion (es decir, LC-LC) como si se tratar del acoplamiento de dos cromatógrafos en línea. Hay casos en que se pueden llegar a combinar varias etapas adicionales de separación. Cuando se da esta situación, la técnica recibe el nombre de HPLC multidimensional.
Cromatografía mediante derivatización post-columna En aquellos casos en que los analitos eluídos de la columna cromatográfica no son fáciles de detectar, bien por su estructura molecular o bien porque el sistema de detección utilizado no es muy sensible, se puede proceder a la derivatización mediante reacciones químicas que mejoren sus características. Estas reacciones de derivatización se llevan a cabo, en continuo, a la salida de la columna cromatográfica y antes de llegar ar detector. El empleo de esta técnica de trabajo en HPLC, dependiendo de los reactivos derivatizantes empleados, puede llegar a aumentar la sensibilidad en un factor superior a 1000, sobre todo cuando se llevan a cabo derivatizaciones para convertir los solutos que no presentan fluorescencia en moléculas fluorescentes y se utiliza un detector de este tipo, mucho más sensible que los detectores de absorción ultravioleta-visible. La derivatización también puede tener lugar antes que la muestra entre en la columna. En estos casos la técnica se conoce como cromatografía mediante derivatización pre-columna.
Clasificación según el mecanismo de separación La separación cromatográfica mediante HPLC se basa en diferentes mecanismos de separación. En función del mecanismo predominante, la cromatografía líquida de alta eficacia recibe los nombres de:
Cromatografía de adsorción La separación se basa fundamentalmente en las distintas afinidades de adsorción de los componentes de la muestra hacia la superficie de un sólido activo. Generalmente están implicados fenómenos de fisisorción del tipo fuerzas de Van der Waals y enlaces de hidrógeno. La fase estacionaria presenta centros activos con dipolos permanentes o inducidos o también terminales con radicales -OH libres. Se caracteriza por utilizar una fase estacionaria sólida (adsorbente) de carácter polar y una fase móvil líquida (eluyente) apolar, por lo que sería el mecanismo habitual en que se basa la cromatografía líquida de alta eficacia en fase normal (NP-HPLC).
Cromatografía de reparto Es el tipo de cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC), más ampliamente utilizado. En esta modalidad, la fase estacionaria es un líquido retenido sobre un soporte sólido e inmiscible con la fase líquida móvil por lo que la separación se produce como consecuencia de la diferencias de solubilidad de los solutos con la fase estacionaria y con la fase móvil. Dependiendo de como se disponga la polaridad de la fase fase móvil, la técnica de separación puede llevarse a cabo mediante cromatografía líquida de reparto en fase fase normal (NP-HPLC) o en fase inversa (RP-HPLC).