miniaturadeimagen| Un vector de expresión bacteriano para expresar la proteína verde fluorescente del promotor T7 . Un vector de expresión, también conocido como constructo de expresión, suele ser un plásmido o virus diseñado para la expresión de genes en las células. El vector se utiliza para introducir un gen específico en una célula diana, y puede comandar el mecanismo de la célula para la síntesis de proteínas para producir la proteína codificada por el gen. Los vectores de expresión son las herramientas básicas de la biotecnología para la producción de proteínas.
El vector está diseñado para contener secuencias reguladoras que actúan como regiones potenciadoras y promotoras y conducen a la transcripción eficiente del gen portado en el vector de expresión.sci.sdsu.edu El objetivo de un vector de expresión bien diseñado es la producción eficiente de proteínas, y esto puede lograrse mediante la producción de una cantidad significativa de ARN mensajero estable, que luego puede traducirse en proteínas. La expresión de una proteína puede estar estrechamente controlada, y la proteína sólo se produce en cantidad significativa cuando es necesario mediante el uso de un inductor; en algunos sistemas, sin embargo, la proteína puede expresarse de forma constitutiva. La Escherichia coli se utiliza habitualmente como huésped para la producción de proteínas, pero también se pueden utilizar otros tipos de células. Un ejemplo del uso del vector de expresión es la producción de insulina, que se utiliza para los tratamientos médicos de la diabetes.
Elementos Un vector de expresión tiene características que puede tener cualquier vector, como un origen de replicación, un marcador seleccionable y un sitio adecuado para la inserción de un gen como el sitio de clonación múltiple. El gen clonado puede transferirse de un vector de clonación especializado a un vector de expresión, aunque es posible clonar directamente en un vector de expresión. El proceso de clonación se realiza normalmente en Escherichia coli. Los vectores utilizados para la producción de proteínas en organismos distintos de E. coli pueden tener, además de un origen de replicación adecuado para su propagación en E. coli, elementos que les permitan mantenerse en otro organismo, y estos vectores se denominan vectores lanzadera.
Elementos de expresión Un vector de expresión debe tener los elementos necesarios para la expresión del gen. Estos pueden incluir un promotor, la secuencia correcta de iniciación de la traducción, como un sitio de unión ribosomal y un codón de inicio, un codón de terminación y una secuencia de terminación de la transcripción. Existen diferencias en la maquinaria para la síntesis de proteínas entre procariotas y eucariotas, por lo que los vectores de expresión deben tener los elementos de expresión adecuados para el huésped elegido. Por ejemplo, los vectores de expresión de procariotas tendrían una secuencia Shine-Dalgarno en su sitio de iniciación de la traducción para la unión de los ribosomas, mientras que los vectores de expresión de eucariotas contendrían la secuencia consenso Kozak.
El promotor inicia la transcripción y, por tanto, es el punto de control de la expresión del gen clonado. Los promotores utilizados en el vector de expresión normalmente son inducibles, lo que significa que la síntesis de proteínas solo se inicia cuando se requiere mediante la introducción de un inductor como IPTG . Sin embargo, la expresión génica también puede ser constitutiva (es decir, la proteína se expresa constantemente) en algunos vectores de expresión. Puede producirse un bajo nivel de síntesis de proteínas constitutivas incluso en vectores de expresión con promotores estrictamente controlados.
Etiquetas de proteínas Tras la expresión del producto génico, puede ser necesario purificar la proteína expresada; sin embargo, separar la proteína de interés de la gran mayoría de las proteínas de la célula huésped puede ser un proceso prolongado. Para facilitar este proceso de purificación, se puede añadir una etiqueta de purificación al gen clonado. Esta etiqueta puede ser una etiqueta de histidina (His), otros péptidos marcadores o un socio de fusión como la glutatión S-transferasa o la proteína de unión a maltosa. Algunos de estos socios de fusión también pueden ayudar a aumentar la solubilidad de algunas proteínas expresadas. Otras proteínas de fusión, como la proteína verde fluorescente, pueden actuar como gen informador para la identificación de genes clonados con éxito, o pueden utilizarse para estudiar la expresión de proteínas en la obtención de imágenes celulares.
Otros El vector de expresión se transforma o transfecta en la célula huésped para la síntesis de proteínas. Algunos vectores de expresión pueden tener elementos para la transformación o la inserción de ADN en el cromosoma del huésped, por ejemplo, los genes vir para la transformación de plantas y sitios de integrasa para la integración cromosómica.
Algunos vectores pueden incluir una secuencia de dirección que puede dirigir la proteína expresada a una ubicación específica, como el espacio periplásmico de las bacterias.
Sistemas de expresión / producción Se pueden utilizar diferentes organismos para expresar la proteína objetivo de un gen, por lo que el vector de expresión utilizado tendrá elementos específicos para su uso en el organismo concreto. El organismo más utilizado para la producción de proteínas es la bacteria Escherichia coli. Sin embargo, no todas las proteínas pueden expresarse con éxito en E. coli, o expresarse con la forma correcta de modificaciones postraduccionales, como las glucosilaciones, y por lo tanto pueden utilizarse otros sistemas.
Bacteriano miniaturadeimagen| Un ejemplo de vector de expresión bacteriano es el plásmido pGEX-3x El huésped de expresión de elección para la expresión de muchas proteínas es Escherichia coli, ya que la producción de proteína heteróloga en E. coli es relativamente simple y conveniente, además de rápida y barata. También hay disponible una gran cantidad de plásmidos de expresión de E. coli para una amplia variedad de necesidades. Otras bacterias utilizadas para la producción de proteínas son el Bacillus subtilis
La mayoría de las proteínas heterólogas se expresan en el citoplasma de E. coli. Sin embargo, no todas las proteínas formadas pueden ser solubles en el citoplasma, y las proteínas incorrectamente plegadas que se forman en el citoplasma pueden formar agregados insolubles llamados cuerpos de inclusión. Estas proteínas insolubles requerirán un nuevo plegado, lo que puede ser un proceso complicado y no necesariamente producir un alto rendimiento. Las proteínas que tienen enlaces disulfuro a menudo no pueden plegarse correctamente debido al entorno reductor del citoplasma, que impide la formación de dichos enlaces, y una posible solución es dirigir la proteína al espacio periplásmico mediante el uso de una secuencia señal N-terminal. Otra posibilidad es manipular el entorno redox del citoplasma. También se están desarrollando otros sistemas más sofisticados, que podrían permitir la expresión de proteínas que antes se consideraban imposibles en E. coli, como las proteínas glicosiladas.
Los promotores utilizados para estos vectores suelen basarse en el promotor del operón lac o en el promotor T7, y normalmente están regulados por el operador lac. Estos promotores también pueden ser híbridos de diferentes promotores, por ejemplo, el promotor tac es un híbrido de los promotores trp y lac. Hay que tener en cuenta que la mayoría de los promotores lac o derivados de lac utilizados se basan en el mutante lacUV5, que es insensible a la represión por catabolitos. Este mutante permite la expresión de la proteína bajo el control del promotor lac cuando el medio de crecimiento contiene glucosa, ya que la glucosa inhibiría la expresión del gen si se utiliza el promotor lac de tipo salvaje. No obstante, la presencia de glucosa puede servir para reducir la expresión de fondo mediante una inhibición residual en algunos sistemas.
Ejemplos de vectores de expresión de E. coli son la serie pGEX de vectores donde la glutatión S-transferasa se usa como socio de fusión y la expresión génica está bajo el control del promotor tac, y la serie pET de vectores que utilizan un promotor T7.
Es posible expresar simultáneamente dos o más proteínas diferentes en E. coli utilizando diferentes plásmidos. Sin embargo, cuando se utilizan dos o más plásmidos, cada uno de ellos debe utilizar una selección de antibióticos diferente, así como un origen de replicación distinto, ya que de lo contrario uno de los plásmidos podría no mantenerse de forma estable. Muchos de los plásmidos utilizados habitualmente se basan en el replicón ColE1 y, por lo tanto, son incompatibles entre sí; para que un plásmido basado en ColE1 coexista con otro en la misma célula, el otro tendría que ser de un replicón diferente, por ejemplo, un plásmido basado en el replicón p15A, como la serie de plásmidos pACYC. Otro enfoque sería utilizar un único vector de dos cistrones o diseñar las secuencias codificadoras en tándem como una construcción bi o policistrónica.
Levadura Una levadura comúnmente utilizada para la producción de proteínas es Pichia pastoris. Ejemplos de vectores de expresión de levadura en Pichia son la serie de vectores pPIC, y estos vectores utilizan el promotor AOX1 que es inducible con metanol. Los plásmidos pueden contener elementos para la inserción de ADN extraño en el genoma de la levadura y la secuencia de señales para la secreción de la proteína expresada. Las proteínas con enlaces disulfuro y glicosilación pueden producirse eficazmente en la levadura. Otra levadura utilizada para la producción de proteínas es Kluyveromyces lactis y el gen se expresa, impulsado por una variante del promotor fuerte de la lactasa LAC4.
Saccharomyces cerevisiae se utiliza especialmente para los estudios de expresión génica en la levadura, por ejemplo en el sistema de dos híbridos de levadura para el estudio de la interacción proteína-proteína. Los vectores utilizados en el sistema de hibridación en dos levaduras contienen socios de fusión para dos genes clonados que permiten la transcripción de un gen reportero cuando hay interacción entre las dos proteínas expresadas a partir de los genes clonados.
Baculovirus En este sistema se utiliza como vector de expresión el baculovirus, un virus con forma de vara que infecta a las células de los insectos. Se utilizan como huéspedes líneas celulares de insectos derivados de lepidópteros (polillas y mariposas), como Spodoptera frugiperda. Una línea celular derivada de la oruga de la col es de especial interés, ya que se ha desarrollado para crecer rápidamente y sin el costoso suero que normalmente se necesita para impulsar el crecimiento celular. El vector lanzadera se llama bacmid, y la expresión del gen está bajo el control de un fuerte promotor pPolh. El baculovirus también se ha utilizado con líneas celulares de mamíferos en el sistema BacMam.
El baculovirus se usa normalmente para la producción de glicoproteínas, aunque las glicosilaciones pueden ser diferentes de las que se encuentran en los vertebrados. En general, es más seguro de usar que el virus de los mamíferos, ya que tiene un rango de hospedadores limitado y no infecta a los vertebrados sin modificaciones.
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