La proteasa similar a la papaína (Papain-like Protease o PLpro''') es una cisteína proteasa esencial para la replicación del coronavirus que pertenece al grupo de peptidasas CA (familia C16). La función primordial de la proteasa similar a la papaína (PLpro) es procesar la poliproteína viral de manera coordinada. No obstante, la PLpro tiene una función adicional que consiste en remover la ubiquitina y la ISG15 de las proteínas de la célula huésped con el fin de ayudar a la evasión del coronavirus. Por estos motivos la PLpro es una diana terapéutica en la investigación de fármacos antivirales contra el SARS-CoV.
Estructura molecular y características
Estructura molecular miniaturadeimagen|309x309px|En esta imagen se puede ver la poliproteína viral del SARS-CoV dividida entre sus diferentes nsp (non-structural proteins). Con detalle se ve la nsp3, donde se localiza la PLpro junto a los dominios SUD y NAB. La Papain-like Protease (PLpro) del SARS-CoV es un monómero de 316 aminoácidos formado por 4 dominios estructurales distintos, que forman una estructura de "mano derecha extendida". Tres de estos dominios se conocen como dominios thumb, palm and fingers; mientras que el cuarto dominio es el conocido como dominio "similar a la ubiquitina" (UBL). Al extremo carboxi-terminal de la PLpro le sigue un dominio SUD (SARS Unique Domain) y al extremo amino-terminal le sigue un dominio NAB (Nucleic Acid Binding domain). Estos son dominios adyacentes a la PLpro que pertenecen al genoma y proteoma de las proteínas no estructurales de la SARS-CoV pero que no forman parte de la PLpro. En concreto, el complejo PLpro está situado entre los aminoácidos 1541 y 1856 de la nsp3 (non-structural protein 3) del SARS-CoV, una proteína de 213 kilo Daltons asociada a la membrana.
Los primeros 62 aminoácidos de la cadena polipeptídica de la PLpro forman el dominio Ubl. Este es un dominio N-terminal que se encuentra separado de los otros 3, y que adopta una estructura secundaria muy similar a la de la proteína ubiquitina. El dominio thumb está formado por 4 hélices alfa (α4-7), el dominio palm se compone por una lámina beta de 6 cadenas (β8-13) y el dominio fingers lo conforma una lámina beta de 4 cadenas retorcidas y antiparalelas (β4-7). La estructura general de la PLpro del SARS-CoV está demostrada que es un 83% idéntica a la PLpro del SARS-CoV-2, sin embargo hay algunas diferencias. Por ejemplo, el dominio UBL cuenta con 60 aminoácidos en lugar de 62 y el dominio thumb está formado por 6 hélices alfa (α2-7) en lugar de tan solo por 4. Pero, por otro lado, todos los residuos importantes del sitio activo de la enzima son invariables entre ambas formas de PLpro. miniaturadeimagen|478x478px|Estructura de la Papain-like Protease tanto de la variante del SARS-CoV-2 como del SARS-CoV en la primera columna. Estructura de las PLpro junto al sustrato ubiquitina en la segunda columna y junto al sustrato ISG15 en la tercera columna. El sitio activo de la PLpro está formado por una tríada catalítica común de cisteína, histidina y ácido aspártico. El residuo de cisteína (C112) está en la base de la hélice α4 del dominio thumb, y a 3,7Å del residuo de histidina (H273) que se encuentra en la base del dominio palm, adyacente al bucle flexible conocido como BL2, o bucle G267–G272, que comprende 6 aminoácidos. Además, el residuo de ácido aspártico (D287) se encuentra a 2,7Å del residuo de histidina.
En el dominio fingers también encontramos dos horquillas beta en las que hay 4 residuos de cisteína. Estos residuos se encargan de coordinar una unión de geometría tetraédrica con un ion de zinc, formando un subdominio de unión de zinc. Esta habilidad de la PLpro para formar una unión de zinc es esencial para el mantenimiento de la actividad de la proteasa y de la integridad de su estructura.
En general, la estructura terciaria de la PLpro es muy similar a las USP (Ubiquitin Specific Proteases), como las USP7 y USP14.
Características miniaturadeimagen|238x238px|De izquierda a derecha: Aminoácidos cisteína, histidina y ácido aspártico. Estos son los tres aminoácidos que forman la tríada catalítica del centro activo de la Papain-Like Protease. La PLpro es una proteasa de carácter ligeramente básico, muy soluble en agua, altamente reactiva y con una gran cantidad de residuos de cisteína en la cadena polipeptídica (en torno a un 3,5%). Es decir, de los 316 residuos que forman la cadena, 11 son cisteínas. De estas, una es la cisteína catalítica del centro activo, y otras cuatro son las encargadas de coordinar la unión del ion zinc. Además, parece que la cisteína catalítica (C112) es el residuo más reactivo dentro de la tríada catalítica, por lo que queda clara la importancia de este aminoácido en la conformación estructural y funcional de la proteasa.
El sitio activo de la enzima tiene propiedades químicas muy similares a otros tipos de PLpro e incluso a otras proteasas con cisteínas catalíticas. En la mayoría de los casos, la cisteína catalítica actúa como residuo nucleófilo, la histidina semeja un par ácido-base y el ácido aspártico promueve la desprotonización de la cisteína.
Mecanismos de actuación La replicación del Coronavirus (CoV) es un proceso altamente sofisticado que incluye maquinarias complejas que siempre implican la total protección del genoma del virus. La síntesis de las proteínas de replicación se inicia por una translación de ORF1a (open reading frames 1a) y ORFab mediante un mecanismo ribosomal que produce dos poliproteínas, la pp1a (486 kDa) i la pp1ab . Estas dos poliproteínas son procesadas por dos proteasas de cisteína codificadas por el virus, la proteasa similar a la papaína (PLpro) y la proteasa similar a la 3-quimotripsina (3‐chymotrypsin‐like protease o 3CLpro). El dominio de la PLpro es codificada como una parte de la proteína no estructural 3 (nsp3) y procesa las proteínas no estructurales 1 y 2. Mientras que el 3CLpro forma parte de la nsp5 y procesa las 12 proteínas no estructurales restantes. Finalizada la generación de las nsps, las nsps ensamblan el complejo de replicación viral en las membranas del huésped iniciando así la replicación y la transcripción del genoma viral. Mecanismo de catalítico miniaturadeimagen|542x542px|Ciclo catalítico de la proteasa similar a la papaína SARS-CoV2. El ciclo en cuestión consta de 6 movimientos estructurales numerados del 1 al 6 y representados dentro de círculos siendo el primer paso el "E" y el último el "E+Q". SARS-CoV PLpro funciona a través de un ciclo catalítico de proteasas cisteínas. En este ciclo la Cys112 actúa de nucleófilo, la His 273 ocupa el rol de funcionar como ácido-base y finalmente la Asp287 se empareja con la histidina para ayudar a alinearse y fomentar la desprotonación de la cisteína.
La comunidad científica aún no ha definido si la protonación de la Cys112 es anterior al ataque nucleófilo en el sustrato. También hay dudas sobre cuáles son las especies nucleófilas reactivas si el ion tiolado de la tiolato-histidina o el tiol de carga neutra que actúa en el mecanismo análogo al de las serinas peptidasas donde después de la reacción con el ligando se producen iones tionio.
En la forma "E" los residuos catalíticos del SARS-CoV PLpro se encuentran enlazados por puentes de hidrógeno y separados por una distancia relativamente pequeña. Al observar este hecho se abre la posibilidad que la Cys112 protonada exista en equilibrio con la His273 y por otro lado que la unión con el sustrato conlleve el equilibro del tiolato reactivo. Aunque no se descarta la opción de que durante la unión del sustrato para formar el complejo "ES" se realice la desprotonación de la Cys112. En el paso siguiente el tiolato de la Cys112 reacciona con el carboneo carbonílico del enlace peptídico y se forma un intermediario tetraédrico cargado negativamente. Este intermediario tetraédrico consta de un oxianión con un residuo de triptófano (Trp107) que se estabiliza con la presencia de un agujero de oxianión adyacente situado donde se unen los sustratos bioquímicos, en el sitio activo de la enzima Plpro. Otros residuos como la asparigina (Asn110) son comunes dentro los PLP2s de los coronavirus y contribuyen en la estabilización del agujero de oxioanión. El siguiente intermediario tioéster "F" es formado debido la eliminación de la amida C-terminal y la destrucción del enlace peptídico. Al añadirse una molécula de agua en el carbono carbonílico del tioéster se forma el segundo intermediario tetraédrico cargado negativamente "TI-2" o"FQ". En este momento del ciclo sucede otra vez la estabilización del oxoanión del "TI-2" gracias el agujero de oxianión en el sitio activo de la PLpro. El quinto paso consta en la separación de la cisteína del intermediario tetraédrico para formar un ácido carboxílico N-terminal "EQ", que se sitúa transitoriamente en el sitio activo de la PLpro mediante un enlace de hidrógeno entre el carbono carbonílico del ácido formado ahora y el nitrógeno de la Trp107. Finalmente, la eliminación del N-terminal cortado del péptido completa el ciclo catalítico de la PLpro. El producto final "Q" es liberado del sitio activo y da lugar la regeneración del enzima "E".
Relación de la PLpro con la Ub y la ISG15 La estructura molecular del dominio catalítico de la PLpro consiste en "una mano derecha extendida" que en el extremo N-terminal se encuentra unida al dominio "similar a la ubiquitina" (UBL). La estructura de la Plpro es similar a la estructura de las enzimas deubiquitinantes (DUB). Asimismo, la caracterización in vitro de las actividades enzimáticas de la PLpro ha revelado que la proteasa similar a la proteína puede reconocer e hidrolizar la ubiquitina (Ub) y la proteína ISG15 (interferon-induced gene 15) de la UBL.
Ambos Ub y ISG15 son elementos importantes durante la señalización de las respuestas innatas del sistema inmunitario del huésped contra la infección del virus y su carencia ha demostrado favorecer la proliferación del virus.
Localización SARS-CoV nsp3 es un polipéptido de 213-kDa involucrado en la replicación del RNA que consiste de siete dominios que van del nsp3a al nsp3g.
La región N-terminal del nsp3 se encuentra intacta entre la mayoría de coronavirus. El nsp3d es la proteasa similar a la papaína (PLpro) que procesa el pp1a i el pp1ab. Esta región contiene un pliegue globular de ubiquitina (ubiquitin-like, Ubl) seguida de un dominio acídico rico en ácido glutámico y del nsp3b un dominio ADP-ribosa-1-fosfotasa.
El dominio catalítico SARS-CoV PLpro y el nsp3 están localizados en la membrana del Retículo Endoplasmático, donde residen la mayoría de dominios en el citosol de la célula. El dominio se encuentra al lado de múltiples enzimas activos catalíticos, dominios transmembrana y dominios cuya función aún desconocemos.
Importancia Médica Los primeros coronavirus causantes de síndromes respiratorios agudos (SARS-CoV) aparecieron durante el año 2002 en la provincia china de Guandong. Este hecho fue el detonante que inició las investigaciones en búsqueda de un posible tratamiento contra su infección. Aun así, a pesar de que la pandemia del SARS-CoV infectó a más de 8500 personas, causó unas 800 muertes y costó billones de dólares a la economía mundial, sigue sin haber una droga antiviral, una vacuna o una terapia monoclonal de anticuerpos clínicamente probada para tratar las infecciones del SARS-CoV.
Por otro lado, la doble funcionalidad de la proteína Papain-Like Protease (PL-Pro) esencial para la replicación de los coronavirus, la convierte en un objetivo importante en el desarrollo de drogas antivirales que inhibirían la replicación viral y reducirían la mortalidad de las infecciones. En ese sentido la mayoría de los estudios se han dirigido a entender detalladamente la estructura y la funcionalidad de la SARS-CoV PLpro y su vital rol en la biogénesis del complejo replicativo de los coronavirus.