Nilonasa o Nylonasa es el nombre común con que se conoce en el ámbito de la ciencia a una clase de enzimas que son capaces de catalizar la hidrólisis de oligómeros del ácido 6-aminohexanoico (Ahx). Estas enzimas pueden aislarse de varias especies bacterianas. El nombre científicamente correcto para estas enzimas es 6-aminohexanoato oligómero hidrolasas. Se cuentan entre las amidasas, que a su vez forman un subgrupo de las hidrolasas. Los sustratos de estas enzimas, los oligómeros del ácido 6-aminohexanoico, solo existen en la Tierra desde el año 1938. Aparecen como subproductos en la producción a gran escala de la poliamida 6 (perlon) y de esa forma ingresan al medio ambiente.
De acuerdo al consenso científico actual, las bacterias dotadas de estas enzimas adquirieron la capacidad de digerir los subproductos de poliamida 6 a través de procesos evolutivos. Es por ello que para los biólogos evolutivos, la aparición de nilonasas en las bacterias es un excelente ejemplo de evolución observable.
Poliamida 6
La poliamida 6 (PA6), también llamada nilón 6, y más conocida bajo la marca Perlon, fue producida por primera vez el 29 de enero de 1938 por el químico alemán Paul Schlack en los laboratorios del departamento de investigación de Aceta GmbH en Berlín-Lichtenberg. Para la síntesis de PA6, Schlack usó la ε-caprolactama que todavía se usa hoy en día como material de partida. La polimerización comienza con ácido 6-aminohexanoico (Ahx), que se forma a partir de ε-caprolactama y agua.
350px|center Formación de ácido 6-aminohexanoico por hidrólisis de ε-caprolactama
Después se hace reaccionar el ácido 6-aminohexanoico con una molécula de ε-caprolactama para formar un dímero, el N-(6-aminohexanoil)-6-aminohexanoato, (Ahx2).
350px|center Reacción de ácido 6-aminohexanoico con ε-caprolactama para dar Ahx2
Este dímero a su vez puede reaccionar con otra molécula ε-caprolactama para formar un trímero. La reacción de polimerización se extiende mediante la adición de otras moléculas de ε-caprolactama. La poliamida 6 consiste esencialmente en más de 100 unidades de ácido aminohexanoico enlazadas entre sí.
250px|center Estructura de la poliamida 6. La letra n representa el número de unidades entrelazadas de ácido 6-aminohexanoico. El grado de polimerización es en promedio n = 100.
thumb|250px|El 1,8-diazaciclotetradecano-2,9-diona, un dímero cíclico del ácido aminohexanoico, es uno de los subproductos de la producción de poliamida-6. Sin embargo, la polimerización es un proceso en gran medida descontrolado que provoca una distribución relativamente amplia de pesos moleculares. Debido a esto, dentro de la estructura del polímero también aparecen compuestos de bajo peso molecular (oligómeros), tales como los dímeros (Ahx2), trímeros (Ahx3), etc., de ácido 6-aminohexanoico. La unión de tipo cabeza-cola también puede dar como resultado oligómeros cíclicos como la 1,8-diazaciclotetradecano-2,9-diona. Estos oligómeros son subproductos no deseados de la producción de poliamida-6.
Las aguas residuales de las plantas de producción de poliamida 6 contienen, además de ε-caprolactama y ácido 6-aminohexanoico, oligómeros lineales y cíclicos de la poliamida 6. La solubilidad de estos oligómeros lineales disminuye con el aumento de la longitud de la cadena. El trímero Ahx3 es soluble en agua en un 1.8%, mientras que el tetrámero Ahx4 lo es en 0.3% y el pentámero Ahx5 solo en 0.01%. El hexámero Ahx6 es casi insoluble en agua. Durante el proceso de producción, los oligómeros se separan con agua caliente del producto deseado y, por lo tanto, entran en las aguas residuales. A medida que el agua de lavado se enfría, la mayoría de los subproductos precipitan como sólidos. Dependiendo del control del proceso y del tamaño de la planta de producción, se producen entre 20 y 180 toneladas de oligómeros y ε-caprolactama por año. Estos residuos de producción a menudo se eliminan por entierro en vertederos. Desde el año 2010 se producen alrededor de 4 millones de toneladas de poliamida 6 en todo el mundo cada año.
Los microorganismos "nativos" no están capacitados para descomponer los subproductos de la industria de la poliamida-6. Ya que esencialmente, solo pueden escindir enlaces C-N peptídicos de α-aminoácidos con la ayuda de peptidasas. Los enlaces amida en posición ε aparecieron en el planeta tierra recién con los primeros experimentos de Schlack, o en el caso de la poliamida 6.6, desde el 28 de febrero de 1935, de la mano de Wallace Hume Carothers.
Las nilonasas y las bacterias que las producen
En 1965, el japonés Takashi Fukumura aisló del agua residual de una operación productora de poliamida-6 de la empresa Toyo Rayon Co., Ltd. (ahora Toray) en Nagoya, once cepas bacterianas diferentes que pudieron crecer en un medio nutriente con 0.6% de ε-caprolactama. Una cepa bacteriana (Corynebacterium aurantiacum) también fue capaz de degradar varios oligómeros lineales y cíclicos del ácido 6-aminocaproico - con la excepción de dímero cíclico del ácido 6-aminohexanoico - Ver metabolismo.
Cuatro años después de Fukumura, otro grupo japonés del mismo entorno aisló una bacteria del género Pseudomonas que fue capaz de metabolizar oligómeros cíclicos del ácido 6-aminohexanoico. Un grupo de investigación dirigido por Hirosuke Okada aisló en 1974 a partir de lodos de aguas residuales a la cepa bacteriana KI72 de Flavobacterium sp.,La bacteria fue clasificada originalmente por los autores como Achromobacter guttatus. que es capaz de utilizar el dímero cíclico de ácido 6-aminohexanoico como única fuente de carbono y nitrógeno para prosperar, La cepa KF71 de flavobacterium aislada dos años antes por el mismo grupo no fue capaz de hacer esto. KI72 es capaz de metabolizar la ε-caprolactama, el ácido 6-aminohexanoico y el dímero cíclico Ahx, así como los dímeros hexaméricos lineales del ácido 6-aminohexanoico. De la bacteria, los investigadores aislaron dos enzimas, una de las cuales cataliza la hidrólisis del dímero cíclico del ácido 6-aminohexanoico a Ahx.2 La otra enzima cataliza la hidrólisis de los oligómeros lineales. La enzima que puede escindir el dímero cíclico del ácido 6-aminohexanoico ha sido probada por su capacidad hidrolítica sobre otros sustratos naturales. Sorprendentemente, no fue capaz de catalizar la hidrólisis de ninguno de los 50 dipéptidos y 16 tripéptidos con los que fue probada. En experimentos posteriores, el número de compuestos naturales con enlace amida, que no forman un sustrato para esta enzima, conocida como NylA, aumentó a más de 100. Tampoco para la enzima, que tiene como sustrato los oligómeros lineales, llamada hoy NylB, se pudo encontrar un sustrato "natural".
El lisado celular obtenido de cultivos cuyo medio nutriente no contenía dímero cíclico no pudo catalizar la hidrólisis del dímero cíclico. A diferencia del lisado celular obtenido de los cultivos con dímero cíclico como medio nutriente. Okada y sus coautores concluyeron de este comportamiento que la hidrolasa del dímero del ácido 6-aminohexanoico es una enzima de expresión inducible , lo que implica que la concentración de la enzima aumenta por la presencia de un inductor, en este caso el dímero cíclico.
Hay dos posibles razones por las cuales una enzima presenta actividad contra un sustrato no natural. En el primer caso, más simple, el sustrato no natural es un análogo estructural al sustrato natural. En el segundo caso, la catálisis se logra mediante una enzima desarrollada evolutivamente que ha perdido su actividad original frente a un sustrato natural a través de una mutación. Dado que Okada y sus coautores no encontraron sustrato natural para la hidrolasa del dímero del ácido 6-aminohexanoico en sus experimentos y esta enzima comparada con otras hidrolasas de amidas cíclicas, como la penicilinasa (> 35 s -1 ), presenta una constante catalítica comparativamente baja k cat (8 s -1 ), concluyeron que la hidrolasa del dímero del ácido 6-aminohexanoico probablemente se formó por adaptación evolutiva.
En 1992, Seiji Negoro y otros colegas del grupo de investigación de Okada aislaron una tercera enzima, ahora llamada NylC, de esta cepa bacteriana. NylC es una endohidrolasa, lo que significa que la enzima cataliza la hidrólisis en el interior (en griego ἔνδον endon , "dentro") de la cadena del oligómero. No tiene actividad contra el dímero cíclico, sino contra el tetrámero y el pentámero cíclicos. NylC tampoco mostró actividad contra los enlaces amida "naturales".
Un total de tres enzimas son responsables de la degradación de los oligómeros del ácido 6-aminohexanoico:
Hidrolasa del dímero cíclico del ácido 6-aminohexanoico (NylA) Hidrolasa del dímero del ácido 6-aminohexanoico (NylB) Endohidrolasa del oligómero del 6-aminohexanoato (NylC)
Comparación de las propiedades de las tres enzimas degradantes de la poliamida 6 de Flavobacterium sp. KI72:
thumb|500px|Representación esquemática de la degradación de los oligómeros de poliamida 6 por las tres nilonasas.
CaracterísticasEnzima Gen nylA nylB nylC Masa molar 52 kDa 42 kDa 37 kDa Número de aminoácidos 493 392 355 pH óptimo 7,4 9,0 7,0 Temperatura óptima 34 °C 40 °C 42 °CActividad específica contra: Ahx2 (Dímeros lineales) <0,001 0,94 0,00044 Ahx3 (Trímeros lineales) <0,001 0,75 0,11 Ahx4 (Tetrámeros lineales) <0,001 0,57 0,42 Ahx5 (Pentámeros lineales) <0,001 0,24 0,47 cyclo(Ahx)2 (Dímeros cíclicos) 2,8 <0,0001 <0,0001 cyclo(Ahx)4 (Tetrámeros cíclicos) <0,001 <0,0001 0,36 ε-Caprolactama <0,001 <0,0001 <0,0001
Los valores de actividad se obtuvieron a una concentración de sustrato de 1 mM y se dan en moles de NH2 por minuto y mg de proteína purificada (U/mg). Los valores verdes indican una actividad significativa hacia el sustrato respectivo.
NylA thumb|Modelo de cintas de la NylA. La hidrolasa del dímero cíclico del ácido 6-aminohexanoico (NylA) cataliza específicamente la hidrólisis de uno de los dos enlaces amida equivalentes en el 1,8-diazaciclotetradecano-2,9-diona, el dímero cíclico del ácido 6-aminohexanoico. Esta reacción da como producto N-(6-aminohexanoil)-6-aminohexanoato, el dímero lineal del ácido 6-aminohexanoico. NylA es parte de la familia con firma amidasa. Los miembros de esta familia de más de 200 enzimas tienen una secuencia conservada de 160 aminoácidos, la firma de la amidasa. Frente a otros oligómeros de poliamida 6, NylA prácticamente no muestra actividad.
NylB thumb|left|Modelo de cintas de la NylB con la mutación D370Y-Mutation La hidrolasa del dímero del ácido 6-aminohexanoico (NylB) tiene en su centro activo la tríada catalítica Ser 112/ Lys 115/Tyr 215 y un agujero de oxianión. La tríada catalítica es similar a la de otras serina hidrolasas bacterianas, tales como la D-alanina transpeptidasa, carboxilesterasa 2 (ESTB) y serina β-lactamasas clase C. Sin embargo, una diferencia clave es el aminoácido tirosina en la posición 170 (Tyr170), que no se encuentra en ninguna otra serina β-lactamasa. Tyr170, a través de su interacción con la tríada catalítica, juega un papel importante en la capacidad de NylB para catalizar la hidrólisis de Ahx2. La unión del sustrato en la enzima aumenta con Tyr170. Además, al interferir un estado de transición tetraédrico, Tyr170 promueve un cambio conformacional en el sustrato favorable para su protonación por Tyr215 de la tríada catalítica. Si la tirosina en la posición 170 se reemplaza por fenilalanina, estéricamente muy similar (Tyr170Phe), la actividad de NylB cae un 1.4% en comparación con Ahx2.
La actividad de NylB sobre oligómeros lineales de poliamida 6 disminuye significativamente al aumentar la longitud de la cadena. Con el hexámero (Ahx6) la actividad es solo el 8% del valor del dímero (Ahx2), en el caso del eicosámero (Ahx20) el valor cae al 0.3%.
Al igual que otras serina proteasas, NylB también exhibe propiedades de esterasa y es capaz de catalizar la hidrólisis de varios ésteres de ácido carboxílico.
NylB'