La criofijación es una técnica para la fijación o estabilización de materiales biológicos como el primer paso en la preparación de muestras para microscopía electrónica y microscopía crioelectrónica. Las muestras típicas para la criofijación incluyen pequeñas muestras de tejido vegetal o animal, suspensiones celulares de microorganismos o células cultivadas, suspensiones de virus o cápsidas de virus y muestras de macromoléculas purificadas, especialmente proteínas.

Congelación profunda El método implica el enfriamiento ultrarrápido de pequeñas muestras de tejido o células a la temperatura del nitrógeno líquido (−196 °C) o inferior, deteniendo todo movimiento y actividad metabólica y preservando la estructura interna mediante la congelación de todas las fases fluidas en sólidas. Típicamente, una muestra se sumerge en nitrógeno líquido o en etano líquido o propano líquido en un recipiente enfriado por nitrógeno líquido. El objetivo final es congelar la muestra tan rápidamente (a 104 a 106 K por segundo) que los cristales de hielo no puedan formarse o se les impida crecer lo suficiente como para causar daños a la ultraestructura de la muestra. La formación de muestras que contienen agua en hielo amorfo es el "santo grial" de la criomicroscopía biológica.

En la práctica, es muy difícil lograr velocidades de enfriamiento lo suficientemente altas como para producir hielo amorfo en muestras de más de unos pocos micrómetros de espesor. Para este propósito, sumergir una muestra en nitrógeno líquido en su punto de ebullición (−196 °C) no siempre congela la muestra lo suficientemente rápido, por varias razones. Primero, el nitrógeno líquido hierve rápidamente alrededor del espécimen, formando una película de gaseoso aislante que ralentiza la transferencia de calor al líquido criogénico, conocido como el efecto Leidenfrost. Las velocidades de enfriamiento se pueden mejorar bombeando el nitrógeno líquido con una bomba de vacío de paletas rotativas durante unas pocas decenas de segundos antes de sumergir la muestra en él. Esto reduce la temperatura del nitrógeno líquido por debajo de su punto de ebullición, de modo que cuando la muestra se sumerge, el nitrógeno líquido envuelve la muestra estrechamente durante un breve período de tiempo y extrae el calor de manera más eficiente. Un enfriamiento aún más rápido se puede obtener sumergiendo las muestras en propano líquido o etano (se ha encontrado que el etano es más eficiente) enfriado muy cerca de sus puntos de fusión usando nitrógeno líquido, o golpeando la muestra contra superficies metálicas altamente pulidas de cobre o plata refrigeradas con nitrógeno líquido (técnica de "aplastamiento" o slam freezing). En segundo lugar, dos propiedades del agua en sí mismas evitan la rápida criofijación en muestras grandes. La conductividad térmica del hielo es muy baja en comparación con la de los metales, y la liberación de calor latente de fusión durante la congelación dificulta el enfriamiento rápido en muestras de más de unos pocos micrómetros de espesor.

Congelación a alta presión La alta presión ayuda a prevenir la formación de grandes cristales de hielo. La congelación a alta presión (HPF, por sus siglas en inglés: high-pressure freezing) es una técnica que aplica presiones de aproximadamente 2100 bar (210 MPa) mientras la muestra se enfría rápidamente, permitiendo la vitrificación de muestras de hasta 200 μm de espesor. Este método permite la criofijación de muestras más gruesas que las que pueden procesarse mediante congelación por inmersión simple, ya que la alta presión suprime la formación de cristales de hielo al modificar el diagrama de fases del agua.

La congelación rápida auto presurizada (SPRF, por sus siglas en inglés: self-pressurized rapid freezing) puede utilizar muchos criógenos diferentes. Recientemente se ha promocionado como una alternativa atractiva y de bajo costo a la congelación a alta presión (HPF).

Aplicaciones y técnicas posteriores Tras la criofijación, las muestras pueden ser procesadas de diversas maneras para su observación en el microscopio electrónico:

Sustitución criogénica (cryo-substitution): La muestra congelada se deshidrata gradualmente a baja temperatura mediante solventes orgánicos que contienen fijadores químicos, para luego ser incluida en resina y seccionada. Esta técnica permite obtener cortes ultrafinos para microscopía electrónica de transmisión y permite la inmunotinción de antígenos que de otro modo se perderían.

Corte criogénico (cryo-sectioning): La muestra congelada se secciona directamente a temperatura criogénica utilizando un ultramicrotomo con cámara fría (crio-ultramicrotomía). Esta técnica es particularmente útil para la inmunocitoquímica, ya que preserva la antigenicidad de las proteínas.

Microscopía crioelectrónica directa (cryo-EM): La muestra se observa directamente congelada en su estado nativo, sin fijación química ni tinción, lo que permite el estudio de estructuras macromoleculares y celulares en un estado cercano al nativo. Esta técnica ha revolucionado la biología estructural en las últimas décadas, permitiendo la determinación de estructuras de alta resolución de complejos macromoleculares.

Fractura-congelación (freeze-fracture): La muestra congelada se fractura y se replica con platino-carbono para su observación en el microscopio electrónico, revelando la estructura de las membranas celulares.

Ventajas y limitaciones La criofijación ofrece varias ventajas sobre los métodos de fijación química convencionales:

Preservación superior de la ultraestructura celular, sin artefactos de extracción o alteración de lípidos. Posibilidad de estudiar procesos dinámicos a través de la congelación ultrarrápida (time-resolved cryofixation). Mejor preservación de la antigenicidad para estudios de inmunomicroscopía.

Sin embargo, presenta algunas limitaciones:

Dificultad técnica y necesidad de equipos especializados. Formación de cristales de hielo en muestras más gruesas (aunque la HPF amplía este rango). La observación directa en cryo-EM requiere mantener la muestra a temperatura criogénica durante toda la observación.

Véase también Criomicroscopía electrónica Vitrificación Sustitución criogénica Hielo amorfo Efecto Leidenfrost Ultramicrotomía Criogenia

Referencias

Bibliografía adicional

Enlaces externos Cryo-electron microscopy – Nature Research Cryo-EM – NCBI Bookshelf

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