thumb|El operón lac y su funcionamiento El operón lac es un operón requerido para el transporte y metabolismo de la lactosa en la bacteria Escherichia coli, así como en algunas otras bacterias entéricas. Presenta tres genes estructurales adyacentes, un promotor, un regulador y un operador. El operón lac es regulado por varios factores, incluyendo la disponibilidad de glucosa y de lactosa. La regulación génica del operón lac fue el primer mecanismo regulatorio de la expresión genética en ser elucidado, y es utilizado a menudo como un ejemplo clásico de la regulación génica en procariotas.
Antecedentes Hasta el año 1960, se pensaba que todos los moldes necesarios para la síntesis proteica se encontraban en el RNA ribosómico (rRNA). Sin embargo, los pesos moleculares de las proteínas varían hasta en dos órdenes de magnitud respecto de los pesos de los rRNA (5S, 16S, y 23S). Este hecho fue puesto de manifiesto por François Jacob y Jacques L. Monod, quienes ya predijeron la existencia del ARN mensajero (mRNA), el cual se sintetizaría a partir de un ADN molde.
Jacob y Monod decidieron estudiar el metabolismo de la lactosa en E. coli, de la cual se sabía que estaba controlada por tres enzimas cuyos genes se encuentran adyacentes en el cromosoma bacteriano.
Una de estas enzimas era la β-galactosidasa, que hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa.También, intervienen otras dos enzimas la galactósido permeasa y la tiogalactósido transacetilasa.
Cuando cultivaban bacterias en glucosa como fuente de carbono podían observar cómo la concentración de β-galactosidasa era muy baja. Al sustituir glucosa por lactosa se observaba un rápido aumento en los niveles de β-galactosidasa y de las otras dos enzimas. Al retirar de nuevo la lactosa, los niveles de las tres enzimas disminuían rápida y drásticamente. Este hecho sugería que los moldes para la síntesis de estas enzimas eran muy inestables, sintetizándose y degradándose rápidamente, lo cual no encajaba con la elevada estabilidad de los rRNAs. Tampoco cabía la posibilidad de que el molde fuera de ADN, que también es muy estable.
Tras analizar numerosos mutantes de E. coli que presentaban un control defectuoso en la inducción de estas enzimas (inducción en ausencia de lactosa, no inducción en presencia de lactosa, etc.) propusieron la existencia de un represor que, uniéndose a una secuencia operadora específica del ADN, regularía la concentración de mRNA.
Todos estos estudios, junto a los realizados por André Lwoff con el bacteriófago λ, permitieron a Jacob y Monod proponer en 1961 una hipótesis unificadora para la regulación génica, llamada posteriormente modelo del operón. Dicho modelo proponía la existencia de represores capaces de unirse a operadores en la secuencia del ADN, los cuales controlaban así la síntesis del mRNA. El mRNA sería una copia complementaria de la secuencia del ADN que codificaba una o varias proteínas (según si hubiera uno o más genes). Al conjunto de genes contiguos más los elementos reguladores que controlan su expresión se le denominó operón.
Estructura y elementos del operón lac
El operón lactosa presenta los siguientes elementos: Genes estructurales: Gen lac z: codifica la enzima β-galactosidasa, que cataliza la reacción de hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa. Gen lac y: codifica la proteína galactósido permeasa, cuya función es facilitar el transporte de la lactosa al interior de la bacteria colocándose en la membrana plasmática y formando un carrier (proteína transportadora). Gen lac a: codifica la enzima tiogalactósido transferasa, que cataliza la transferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de un aceptor tiogalactósido. Este gen no está relacionado con el metabolismo de la lactosa. Promotor: región del DNA, precedente a los genes estructurales, que reconoce la RNA polimerasa para llevar a cabo la transcripción. Operador: región del DNA localizada entre el promotor y el comienzo de los genes estructurales, que es reconocida por la proteína represora Lac I. Gen represor (lac I): codifica la proteína represora Lac I, que reconoce la región operadora, donde se une. Impide la transcripción de los genes bajo el control de este promotor pero estimula la unión de la RNA polimerasa formando lo que se conoce como Complejos Cerrados. Cuando el represor se retire (en presencia de inductor que en este caso será lactosa o IPTG), la RNA polimerasa estará lista para formar Complejos Abiertos y empezar la transcripción.
thumb|center|900px|Estructura del operón lac.
Regulación del operón lac
El operón lac se encuentra bajo un tipo de regulación negativa, donde los genes pueden transcribirse siempre, salvo cuando la proteína represora Lac I se encuentra unida a la región operadora, por la cual presenta una elevada afinidad. En este caso, el promotor del gen lac I es constitutivo, por lo que la proteína Lac I se expresa permanentemente y permanece unida en forma de tetrámero a la zona operadora, impidiendo la transcripción de los genes estructurales. La regulación del operón funcionaría de la siguiente forma: En presencia de lactosa: la lactosa es el inductor del operón. Es capaz de unirse a la proteína represora Lac I y generar un cambio conformacional que disminuye su afinidad por la región operadora. De esta forma, la región operadora queda libre, la RNA polimerasa puede transcribir libremente los genes estructurales y la β-galactosidasa puede degradar la lactosa a glucosa más galactosa. En ausencia de lactosa: en ausencia de inductor, la proteína represora Lac I mantiene su elevada afinidad por la región operadora, impidiendo que la RNA polimerasa transcriba los genes estructurales. De esta forma, el sistema permanece cerrado con el consecuente ahorro energético para la bacteria.
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La verdadera molécula inductora del operón lac es la alolactosa, un isómero de la lactosa que se obtiene por una transglicosilación llevada a cabo ocasionalmente por la β-galactosidasa.
El mRNA de los genes estructurales presenta una vida media de unos tres minutos, lo que permite que la inducción pueda revertirse rápidamente en ausencia de lactosa.
Por último, cabe destacar que el operón lac presenta una expresión basal, al igual que la mayoría de los operones. Esto quiere decir que, en ausencia de inductor, el operón puede expresar los genes estructurales en muy baja concentración y así mantener unas bajas concentraciones de β-galactosidasa y de permeasa. La permeasa permitirá que pueda entrar inicialmente la lactosa en la bacteria y la β-galactosidasa permitirá transglicosilar la lactosa y transformarla en alolactosa, el verdadero inductor del operón lac. A medida que entre más lactosa en la bacteria, se irán expresando en mayor medida los genes estructurales.
Represión catabólica
El operón lac presenta además otro tipo de regulación que viene mediada por el AMP cíclico y la proteína CRP (catabolite repressor protein). A lo largo de todo su estudio, Jacob y Monod también pudieron observar cómo las bacterias eran capaces de seleccionar la fuente de carbono que utilizaban cuando tenían más de una a su alcance. Este comportamiento era lógico desde el punto de vista del ahorro energético, pero ¿cómo hacían las bacterias para «elegir»?
Cuando las bacterias crecen en glucosa más lactosa como fuentes de carbono, primero utilizan la glucosa y solo después, tras haber agotado la glucosa, utilizan la lactosa, en lo que se denomina crecimiento diaúxico. Además, se puede observar que, a pesar de estar el inductor (lactosa) presente, no hay transcripción de los genes estructurales del operón lac.
La respuesta se encontró al observar que la transcripción de los genes estructurales no dependía únicamente de la ausencia del represor Lac I en la región operadora, sino que además era necesario que se uniera la proteína CRP más AMPc alrededor de la región -60, respecto del comienzo del gen lac Z. La proteína CRP se encuentra en forma de dímero y solo es activa cuando lleva unido AMPc. El alto contenido de AMPc se debe a que en ausencia de transporte de glucosa al interior celular se aumenta la actividad de la adenilato ciclasa (enzima encargada de la síntesis de AMPc). Aquellos mutantes para la adenilato ciclasa (que no producen AMPc) o para la proteína CRP presentaban niveles muy bajos de expresión de los genes del operón lac. Por lo tanto, sin CRP o sin AMPc el sistema permanecería cerrado. Esto unido al hecho de que la glucosa disminuía los niveles de AMPc daba la explicación por la cual la glucosa ejercía una represión por catabolito. Este tipo de represión se ha podido observar también en el operón de la arabinosa, de la galactosa, de la maltosa... De este modo, la presencia de glucosa inhibe de forma conjunta muchos operones que regulan la utilización de fuentes alternativas de carbono y energía, es decir, la represión catabólica constituye un regulón.
Análogos de la lactosa
Se han encontrado una serie de moléculas derivadas o análogas de la lactosa, las cuales han sido de gran utilidad a la hora de trabajar con el operón lac en el laboratorio. La mayoría de estos compuestos son galactósidos derivados de la lactosa, donde la glucosa ha sido sustituida por algún radical o grupo químico. A continuación se pueden observar los análogos de lactosa más representativos: IPTG (isopropil-β-D-tiogalactósido): suele utilizarse como inductor artificial del operón lac, ya que es capaz de unirse al represor LacI, pero no es un sustrato para la β-galactosidasa y no puede ser metabolizado por la bacteria. Además, el IPTG es transportado eficientemente al interior de la bacteria en ausencia de la permeasa, con lo que su entrada es independiente de la expresión del gen lac y. Fenil-Gal (fenil-β-D-galactosa): es un sustrato de la β-galactosidasa, pero no es un inductor del operón, ya que es incapaz de unirse al represor LacI. Esto hace que las cepas bacterianas silvestres sean incapaces de crecer cuando su única fuente de carbono es fenil-gal. Solo aquellos mutantes donde se encuentre ausente el represor LacI podrán crecer en esta fuente de carbono. ONPG (orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido): es un sustrato de la β-galactosidasa que, al ser hidrolizado, produce un compuesto (ortonitrofenol) que presenta un intenso color amarillo. El ONPG es muy utilizado en los ensayos in vitro de β-galactosidasa, en los que se puede obtener la concentración de β-galactosidasa en función de la intensidad del color amarillo, medida por absorbancia a una longitud de onda de 420 nm. X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido): es otro sustrato de la β-galactosidasa que, al ser hidrolizado, produce un compuesto (indoxil) que en contacto con el aire se transforma en índigo insoluble, el cual presenta un intenso color azul. Es utilizado como indicador de expresión de la β-galactosidasa en colonias bacterianas creciendo en placa. Aquellas colonias que estén expresando la enzima se tornarán de un color azul más o menos intenso en función de la cantidad de enzima que estén expresando. Alolactosa: es un isómero de la lactosa y es el verdadero inductor del operón lac. Mientras que la lactosa es galactosa-(β1-4)-glucosa, la alolactosa es galactosa-(β1-6)-glucosa. La lactosa, una vez en el citoplasma bacteriano, es transformada en alolactosa por la β-galactosidasa.
Nomenclatura genética
Se utilizan códigos de tres letras para describir los fenotipos de las bacterias. Ejemplos de esto son: Lac (capacidad de utilizar lactosa como fuente de carbono), His (capacidad de sintetizar el aminoácido histidina), Mot (motilidad natatoria) y Str (resistencia al antibiótico estreptomicina). En el caso de Lac, las cepas silvestres son Lac+, presentando la capacidad de utilizar lactosa como una fuente de carbono y de energía, y los mutantes Lac-, derivados de ellas que han perdido dicha capacidad y no pueden usar la lactosa.