El Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR o ARMS-PCR por sus siglas en inglés (Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction) es una técnica para detectar mutaciones puntuales conocidas, que se cree que fue descrita por primera vez por el equipo de Newton en 1989. Se ha desarrollado para el diagnóstico de todas las mutaciones β-talasemia comunes que se encuentran en diferentes grupos étnicos alrededor del mundo y sobre todo en los países asiáticos. La técnica se basa en que un cebador específico solo permita que la amplificación tenga lugar cuando su extremo 3' coincida con su secuencia diana. Por ejemplo, para detectar la mutación β-talasemia (G / C), el nucleótido en el extremo 3' del cebador es una guanina con el fin de que si se encuentra con una citocina, el nucleótido sustituido en el ADN mutante, si no se lleva a cabo la amplificación sería debido a que el cebador formaría un desajuste o "mismatch" G-G con el ADN normal. Esta falta de correspondencia es débil, entonces para que se pueda reducir la eficiencia de hibridación de los cebadores con la cadena molde de ADN entre un 0 y 5% para así evitar la amplificación, una mayor falta de correspondencia con la secuencia diana u objetivo tendría que ser introducida en el segundo, tercero o cuarto de los nucleótidos antes del extremo 3' del cebador utilizado.
Antecedentes históricos En 1989, algunos grupos independientes describieron un tipo de PCR que podría ser utilizada para el análisis de mutaciones puntuales conocidas en el ADN y que así se pudiera distinguir entre el alelo normal, el genotipo heterocigoto y los genotipos mutantes o normales homocigotos; estos grupos independientes fueron los de Newton, Nichols, Okayama, Sommer y Wu. El método se conoce como PCR-ARMS o únicamente ARMS (Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR) nombrado así en el texto publicado por Newton en 1989, como PASA (PCR para la amplificación de alelos específicos) por Sommer y como ASPCR (PCR alelo-específico) por Wu. La aplicabilidad es la de analizar mutaciones asociadas a enfermedades conocidas como la fenilcetonuria y anemia de células falciformes; posteriormente, en 1992, el equipo de investigación liderado por Sommer realizó estudios de validación que establecieron que esta nueva estrategia de Reacción en Cadena de la Polimerasa es aplicable al análisis de cualquier mutación puntual conocida o Polimorfismo de un solo nucleótido.
En su artículo Analysis of any point mutation in DNA. ARMS., Newton y su equipo dijeron: "Hemos mejorado la "Reacción en Cadena de la Polimerasa" (PCR) para permitir el análisis rápido de cualquier mutación conocida en el ADN genómico. Demostramos un sistema, ARMS (Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR) que permite el genotipado únicamente por la inspección de las mezclas de reacción después de la electroforesis en gel de agarosa. El sistema es simple y fiable, permite distinguir claramente alelos heterocigotos u homocigotos en un locus para cualquiera de los dos alelos. El sistema no requiere ni la digestión con enzimas de restricción o de oligonucleótidos específicos de alelos como son aplicados convencionalmente, ni el análisis de la secuencia de los productos de PCR. La base de la invención son los oligonucleótidos que no se unan a la cadena molde en el extremo 3' , así no funcionarían como cebadores en la PCR en condiciones apropiadas. Hemos analizado el ADN de pacientes con calantitripsina (AAT), de portadores de la enfermedad y de individuos normales. Nuestros resultados están en completo acuerdo con las asignaciones de los alelos derivados de la secuenciación directa de los productos de la PCR ... La viabilidad de la PCR-ARMS descrita por Newton se demostró por la amplificación del exón III y parte del intrón III en el gen de AAT humano. La aplicación directa de la PCR-ARMS a los alelos clínicamente significativos se realizó y los diagnósticos estaban de acuerdo con los resultados del análisis de la secuencia de los productos de PCR".
Los grupos independientes antes mencionados demostraron una técnica general que permite la verificación de cualquier polimorfismo o mutación puntual conocidos. La técnica requiere que el extremo terminal 3' de los cebadores de PCR sea específico para los alelos conocidos, tanto mutante como normal. Así, el cebador inicia la síntesis en dos formas. Si el alelo es de la forma "normal", entonces es refractario a la amplificación por PCR sobre la cadena de ADN "mutante", mientras que si la forma es "mutante" es refractario a la PCR sobre el ADN "normal". En algunos casos una sola base que no concuerde sí permite la amplificación, de manera que demostraron que la introducción de algunos otros desajustes adicionales cerca del extremo 3 ' de los cebadores apropiados aminora este problema.
ARMS es un método simple, rápido y confiable que proporciona precisión a la hora de hacer un diagnóstico pre- y posnatal y un medio para la detección de heterocigotos. ARMS sigue siendo de beneficio aún si las mutaciones asociadas a la enfermedad, hasta ahora no caracterizada, están vinculados a los polimorfismos caracterizados. En tales casos, la técnica permitirá analizar el haplotipo de manera detallada con una cantidad mínima de ADN. Los diagnósticos prenatales precisos son alcanzables en unas pocas horas si se evita la contaminación materna a partir de material fetal, aunque hoy en día las tecnologías y métodos de diagnóstico con ADN fetal circulante parecen prometedoras. Una consideración práctica importante con este enfoque (como con otras estrategias basadas en la Reacción en Cadena de la Polimerasa) es que es innecesario preparar ADN de alta calidad, adecuado para la digestión con enzimas de restricción.
Un requisito previo de la PCR-ARMS es la ausencia de una actividad correctora 3'-exonucleolítica asociada con la ADN polimerasa, igual que el extremo 3'-OH de los cebadores coincidentes sean refractarios a la extensión por la polimerasa de ADN elegida. En los casos en que la falta de coincidencia no es refractaria a la extensión (como se demostró en los resultados de la experimentación de Newton en 1989), son requeridos algunos desajustes más desestabilizadores. Empíricamente, el grado de especificidad observada con los cebadores no coincidentes (y por tanto el requisito de que la desestabilización adicional se lleve a cabo), se correlaciona con el tipo de desajuste. C / T, A / A y desajustes de T / T (que son todos o bien purina / purina o desajustes pirimidina / pirimidina) son considerablemente más refractarios a la extensión por la Taq Polimerasa que los desajustes G / T, T / G, A / C o C / A (donde todos son desajustes purina / pirimidina).
Es probable que cualquiera de estos enfoques para desestabilizar deliberadamente los cebadores de la PCR-ARMS y, por lo tanto, mejorar la especificidad puede ser mediante la reducción de dNTPs, magnesio y concentraciones de cebador o el simple aumento de las temperaturas de amplificación / extensión y de hibridación. Por el contrario, un aumento en la concentración de estos reactivos o una disminución de la temperatura de amplificación podría suponer que tenga un efecto adverso sobre las especificidades de los cebadores de manera que no generen previamente ningún producto deseado.
La optimización de las concentraciones de magnesio, Taq polimerasa, dNTP y / o de la temperatura exacta a través de los ciclos de la PCR-ARMS, el control cuidadoso de la variable debe ser alcanzable con la instrumentación totalmente automatizada de la PCR-ARMS. De hecho, la adición de Taq polimerasa para mezclas de reacción a 60 °C y asegurar que la temperatura de reacción nunca cae por debajo de ésta, puede aumentar significativamente la especificidad de reacción y evitar la generación de productos en plantillas no coincidentes.
Hemos elegido utilizar grandes cebadores (30-meros) en este ensayo ya que esto permite el uso de altas temperaturas de amplificación para mejorar la especificidad y reduce la posibilidad de un mal acoplamiento de los cebadores en otros lugares del ADN genómico. Un enfoque alternativo podría ser el uso de cebadores más cortos que abarquen una mutación puntual tal que la discriminación entre loci "normal" y "mutante" se logre mediante la hibridación de los cebadores de una manera específica con ciertos alelos en condiciones apropiadas, naturalmente. Es importante tener en cuenta, sin embargo, que en este análisis de la especificidad de los cebadores no se habla de algo absoluto, la ausencia de controles internos podría concebiblemente dar lugar a diagnósticos erróneos y la hibridación de los mismos cebadores. Otras desventajas serían que las diferentes condiciones tendrían que ser determinadas para cada locus de interés lo que complicaría el análisis simultáneo de múltiples loci. "No se nos escapa que la PCR-ARMS puede tener muchas otras aplicaciones en la medicina y la biología molecular. La técnica será útil para la tipificación precisa de los patógenos infecciosos con base en los cambios específicos de la cepa, característicos para cada una, de manera que pueden ser identificados. El análisis de activación de oncogenes es así sencillo al igual que la detección de deleciones en el ADN. Muchas aplicaciones adicionales también se pueden considerar en el contexto de la investigación."-Newton et al., 1989
Principio La PCR-ARMS se basa en la observación de que la amplificación por PCR es ineficiente o completamente refractaria si hay un desajuste entre el nucleótido terminal de un cebador en su extremo 3' y la plantilla correspondiente. La Taq ADN polimerasa carece de una actividad de exonucleasa y por lo tanto no se pueden corregir desajustes en los extremos 3' del cebador. Como tal, se requiere la hibridación de bases complementarias en el extremo 3' del cebador para la amplificación eficiente de Taq DNA polimerasa; la amplificación del alelo normal, y no el de la mutante, se lleva a cabo utilizando un cebador que es complementaria al alelo normal y tiene un desajuste entre el residuo 3' y el alelo mutante. Por el contrario, solo el mutante se amplificará si el residuo 3' del cebador es complementario al alelo mutante y no el alelo normal. La especificidad o poder de discriminación del nucleótido terminal en el extremo 3' se puede mejorar aún más si se incorpora una asimetría adicional posicionado cerca del nucleótido 3'.
Varios estudios han intentado cuantificar el efecto inhibidor de diferentes desajustes en la amplificación por PCR, como aquellos de los últimos años de la década de 1990. Aunque han surgido algunas tendencias, los resultados han sido notablemente discordantes. Sarkar y sus colegas, en 1990, concluyeron que la PCR es inhibida por desajustes entre la plantilla y el nucleótido en el extremo 3' del cebador. Por otra parte, Kwok y su equipo en 1990 demostraron una reducción de 20 veces en la eficiencia de la amplificación con desajustes A : A (cebador : molde), la reducción de 100 veces con desajustes A : G, G : A, y C : C, y poca o ninguna reducción con otros desajustes. En 1992, Huang y sus colaboradores demostraron algún grado de inhibición con cada combinación de desajustes. La inhibición más débil, la reducción de aproximadamente 100 veces, se asoció con desajustes C : T . Había aproximadamente 10 veces una reducción con desajustes A : C, C : A, G : T, y desajustes; G: 34T 10 a 10 veces de reducción con desajustes T : C y T 6: T ; y al menos 10 veces la tasa de reducción con desajustes A : A, G : A, A : G, G : G, y C : C. Ayyadevara y colegas, que realizaron ciertos experimentos en el año 2000 variaron sistemáticamente tanto el extremo terminal 3' y los nucleótidos de los penúltimos cebadores, todo ello bajo condiciones de relativamente alta rigurosidad. Su estudio indica que los cebadores que terminan Adenina son moderadamente inferiores a los que terminan en otros nucleótidos.